血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ
Summary
ここで紹介する方法は、in vivo で血管新生または血管透過性に対する試薬の効果を染色なしで評価できます。この方法では、尾静脈からデキストランFITC注射を使用して、血管新生または血管漏出を視覚化します。
Abstract
in vivoでの血管新生を調べるために、いくつかのモデルが開発されています。しかし、これらのモデルのほとんどは複雑で高価であり、特殊な機器を必要としたり、その後の定量分析のために実行したりするのが困難です。ここでは、in vivoでの血管新生を評価するための修飾マトリックスゲルプラグアッセイを紹介します。このプロトコルでは、血管細胞は、血管新生促進剤または血管新生防止試薬の存在下または非本位でマトリックスゲルと混合され、次にレシピエントマウスの背部に皮下注射されました。7日後、デキストラン-FITCを含むリン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から注入し、血管内を30分間循環させる。マトリックスゲルプラグを回収し、組織包埋ゲルで包埋した後、12 μm切片を切断して染色せずに蛍光検出を行います。このアッセイでは、高分子量(~150,000 Da)のデキストラン-FITCを使用して機能性血管の長さを示し、低分子量(~4,400 Da)のデキストラン-FITCを使用して新血管の透過性を示すことができます。結論として、このプロトコルは生体内の血管新生の量的な調査に信頼できる、便利な方法を提供できる。
Introduction
血管新生は、既存の血管から新血管を形成するプロセスであり、胚発生、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍発生など、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします1,2,3,4,5。このダイナミックなプロセスには、マトリックスの分解、血管細胞の増殖、管状構造を形成するための移動と自己組織化、および新血管の安定化など、いくつかのステップが含まれます6。血管新生の促進は、心筋梗塞、脳卒中、その他の虚血性疾患の治療において重要であることが実証されており7、血管新生の阻害は、がん8やリウマチ性疾患9の治療において有望な戦略と考えられています。血管新生は創薬の組織化原理と考えられてきた10。したがって、血管新生の程度を評価するための信頼性が高く便利な方法の構築は、血管新生依存性疾患における機械的研究または創薬にとって重要です。
血管新生を評価するために、いくつかのin vitroおよびin vivoモデルが開発されている11。これらのうち、マトリックスゲルチューブ形成アッセイ12のような2次元(2D)モデルは、機能的な管状構造を形成することができない。後肢虚血モデル13,14などの動物モデルは、血管新生過程を再現することができるが、複雑であり、レーザースペックル血流イメージングシステムを必要とする。マトリックスゲルプラグアッセイのような血管形態形成の3Dモデルは、in vivoでの血管新生のプロセスを模倣できるシンプルなプラットフォームを提供する15が、血管新生の検出には免疫組織化学または免疫蛍光染色16,17,18が必要であり、これらはばらつきがあり、視覚化が不十分である。
ここでは、血管細胞をマトリックスゲルと混合し、マウスの背中に皮下注射してプラグを形成する改変マトリックスゲルプラグアッセイのプロトコルについて説明します。プラグでは、血管細胞がマトリックスを分解し、増殖し、移動し、自己組織化して、最終的に内部環境で血流のある機能的な血管を形成する必要があります。その後、蛍光標識デキストランを尾静脈から注入してプラグ内を流れ、標識を可視化して血管新生を示します。血管新生の内容は、血管の長さによって定量的に評価することができる。この方法は、2次元血管新生モデル12では作製できない機能性血管を形成することができ、通常のマトリックスゲルプラグアッセイ11のような複雑な染色プロセスを必要としない。また、後肢虚血モデル13,14,19のレーザースペックル血流イメージングシステムのような高価な特定の機器を必要としません。この方法は、汎用性が高く、低コストで、定量化可能で、実行が容易であり、薬物の血管新生促進能力または抗血管新生能力を決定するために使用したり、血管新生に関与する機械的研究に使用したりできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
染色せずに in vivo での血管新生を定量的に評価するための信頼性が高く簡便な方法を紹介します。このプロトコルでは、血管細胞を血管新生促進剤または抗血管新生試薬の存在下でマトリックスゲルと混合し、Nu/Nuマウスの背中に皮下注射してゲルプラグを形成しました(図1)。ゲルプラグ形成の7日後、デキストラン-FITCを静脈内注射し、30分間循環させた。ゲルプ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、浙江省自然科学基金会(LY22H020005)と中国国家自然科学基金会(81873466)から資金提供を受けました。
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
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