Modifisert in vivo matriks gelplugganalyse for angiogenesestudier
Summary
Metoden som presenteres her kan evaluere effekten av reagenser på angiogenese eller vaskulær permeabilitet in vivo uten farging. Metoden bruker dextran-FITC injeksjon via halevenen for å visualisere neo-kar eller vaskulær lekkasje.
Abstract
Flere modeller er utviklet for å undersøke angiogenese in vivo. Imidlertid er de fleste av disse modellene komplekse og dyre, krever spesialutstyr, eller er vanskelige å utføre for påfølgende kvantitativ analyse. Her presenterer vi en modifisert matriks gelplugganalyse for å evaluere angiogenese in vivo. I denne protokollen ble vaskulære celler blandet med matriksgel i nærvær eller fravær av proangiogene eller antiangiogene reagenser, og deretter subkutant injisert på baksiden av mottakermus. Etter 7 dager injiseres fosfatbuffersaltvann inneholdende dekstran-FITC via halevenen og sirkuleres i kar i 30 minutter. Matriksgelplugger samles og bygges inn med vevsinnbyggingsgel, deretter kuttes 12 μm seksjoner for fluorescensdeteksjon uten farging. I denne analysen kan dextran-FITC med høy molekylvekt (~ 150 000 Da) brukes til å indikere funksjonelle kar for å oppdage lengden, mens dextran-FITC med lav molekylvekt (~ 4 400 Da) kan brukes til å indikere permeabiliteten til neo-fartøy. Avslutningsvis kan denne protokollen gi en pålitelig og praktisk metode for den kvantitative studien av angiogenese in vivo.
Introduction
Angiogenese, prosessen med dannelse av neo-fartøy fra eksisterende kar, spiller en kritisk rolle i mange fysiologiske og patologiske prosesser, som embryonisk utvikling, sårheling, aterosklerose, tumorutvikling, etc.1,2,3,4,5. Denne dynamiske prosessen innebærer flere trinn, inkludert nedbrytning av matrisen, vaskulær celleproliferasjon, migrasjon og selvorganisering for å danne rørformede strukturer og stabilisering av neo-fartøyene6. Fremme av angiogenese har vist seg å være kritisk ved behandling av hjerteinfarkt, hjerneslag og andre typer iskemiske sykdommer7 mens hemming av angiogenese har blitt ansett som en lovende strategi i behandlingen av kreft8 og revmatoid sykdom9. Angiogenese har vært ansett som et organiserende prinsipp for legemiddeloppdagelse10. Dermed er konstruksjonen av en pålitelig og praktisk metode for å vurdere omfanget av angiogenese kritisk for mekanisk forskning eller legemiddeloppdagelse i angiogeneseavhengige sykdommer.
Flere in vitro og in vivo modeller er utviklet for å evaluere angiogenese11. Blant disse kan todimensjonale (2-D) modeller, som matriksgelrørdannelsesanalyse12, ikke danne funksjonelle rørformede strukturer. Dyremodellene, som bakre lem iskemi modell13,14, kan reprodusere angiogeneseprosessen, men er komplekse og krever et laserflekkblodstrømsavbildningssystem. 3D-modeller av vaskulær morfogenese, som matriksgelplugganalyse, gir en enkel plattform som kan etterligne angiogeneseprosessen in vivo15, men påvisning av angiogenese krever immunhistokjemi eller immunfluorescensfarging 16,17,18, som er variable og dårlig visualisert.
Her beskriver vi en protokoll for en modifisert matriksgelplugganalyse der vaskulære celler ble blandet med matriksgel og subkutant injisert på baksiden av mus for å danne en plugg. I pluggen må vaskulære celler nedbryte matrisen, spre seg, migrere og selvorganisere for endelig å danne funksjonelle kar med blodstrøm i det indre miljøet. Deretter injiseres fluorescerende merket dextran via halevenen for å strømme gjennom pluggen, og etiketten visualiseres for å indikere neo-fartøy. Innholdet av angiogenese kan kvantitativt evalueres av fartøyets lengde. Denne metoden kan danne funksjonelle kar som ikke kan produseres i 2-D angiogenesemodeller12, og trenger ikke kompleks flekkprosess som i vanlig matriksgelplugganalyse11. Det krever heller ikke dyre spesifikke instrumenter som laser speckle blood flow imaging system i baklem iskemi modell 13,14,19. Denne metoden er allsidig, billig, kvantifiserbar og enkel å utføre, og kan brukes til å bestemme pro- eller anti-angiogen evne til legemidler eller brukes i mekanisk forskning involvert i angiogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer en pålitelig og praktisk metode for kvantitativ evaluering av angiogenese in vivo uten farging. I denne protokollen ble vaskulære celler blandet med matriksgel i nærvær av proangiogene eller antiangiogene reagenser, og deretter subkutant injisert på baksiden av Nu/Nu-mus for å danne gelplugg (figur 1). Etter 7 dager med dannelse av gelplugger ble dekstran-FITC injisert intravenøst og sirkulert i 30 minutter. Gelpluggen ble samlet opp og innebygd med vevsembeddi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H020005), og National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
