Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Summary

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Abstract

Vários modelos têm sido desenvolvidos para investigar a angiogênese in vivo. No entanto, a maioria desses modelos é complexa e cara, requer equipamentos especializados ou é de difícil execução para posterior análise quantitativa. Apresentamos aqui um ensaio de plugue de gel de matriz modificado para avaliar a angiogênese in vivo. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença ou ausência de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso dos camundongos receptores. Após 7 dias, tampão fosfato salino contendo dextran-FITC é injetado através da veia caudal e circulado nos vasos por 30 min. Os plugues de gel de matriz são coletados e embebidos com gel de incorporação de tecido, em seguida, cortes de 12 μm são cortados para detecção de fluorescência sem coloração. Neste ensaio, dextran-FITC com alto peso molecular (~150.000 Da) pode ser usado para indicar vasos funcionais para detectar seu comprimento, enquanto dextran-FITC com baixo peso molecular (~4.400 Da) pode ser usado para indicar a permeabilidade de neo-vasos. Em conclusão, este protocolo pode fornecer um método confiável e conveniente para o estudo quantitativo da angiogênese in vivo.

Introduction

A angiogênese, processo de formação de neovasos a partir de vasos pré-existentes, desempenha papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, como desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, aterosclerose, desenvolvimento tumoral, etc.1,2,3,4,5. Esse processo dinâmico envolve várias etapas, incluindo a degradação da matriz, proliferação de células vasculares, migração e auto-organização para formar estruturas tubulares e a estabilização dos neovasos⁶. A promoção da angiogênese tem se mostrado fundamental no tratamento do infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e outros tipos de doenças isquêmicas7, enquanto a inibição da angiogênese tem sido considerada uma estratégia promissora no tratamento de^cânceres8 e doenças reumatoides9. A angiogênese tem sido considerada um princípio organizador para a descoberta de^{fármacos 10}. Assim, a construção de um método confiável e conveniente para avaliar a extensão da angiogênese é fundamental para a pesquisa mecânica ou descoberta de drogas em doenças dependentes de angiogênese.

Vários modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para avaliar a angiogênese11. Dentre estes, modelos bidimensionais (2-D), como o ensaio de formação de tubos de gel de matriz¹², não podem formar estruturas tubulares funcionais. Os modelos animais, como o modelo de isquemia de membro^{pélvico13,14}, podem reproduzir o processo de angiogênese, mas são complexos e requerem um sistema de imagem de fluxo sanguíneo pontilhado a laser. Modelos 3D de morfogênese vascular, como o matrix gel plug assay, fornecem uma plataforma simples que pode mimetizar o processo de angiogênese di^vivo15, mas a detecção de angiogênese requer imunohistoquímica ou coloração de imunofluorescência16,17,18, que são variáveis e pouco visualizadas.

Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de plugue de gel de matriz modificado onde células vasculares foram misturadas com gel de matriz e injetadas subcutaneamente no dorso de camundongos para formar um plug. No plug, as células vasculares precisam degradar a matriz, proliferar, migrar e se auto-organizar para finalmente formar vasos funcionais com fluxo sanguíneo no ambiente interno. Depois disso, o dextran fluorescente é injetado através da veia da cauda, para fluir através do plugue, e o rótulo é visualizado para indicar neo-vasos. O conteúdo da angiogênese pode ser avaliado quantitativamente pelo comprimento dos vasos. Esse método pode formar vasos funcionais que não podem ser produzidos em modelos de angiogênese^2D12 e não necessita de processos complexos de coloração como no ensaio de plugue de gel de matriz^comum11. Também não requer instrumentos específicos de alto custo, como o laser speckle blood flow imaging system no modelo de isquemia de membro pélvico13,14,19. Este método é versátil, de baixo custo, quantificável e de fácil execução, podendo ser utilizado para determinar a capacidade pró ou antiangiogênica de fármacos ou ser utilizado em pesquisas mecânicas envolvidas na angiogênese.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 de julho de 2021). Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Tabela de Materiais. 1. Preparo do meio de cultura Meio de cultura 10x M199: Dissolver o pó M199 na concentração de 10x com 90 mL de água deionizada e adicionar 10 mL de soro fetal bovino (SFB), p…

Representative Results

A Figura 1 é o fluxograma descrevendo como preparar a mistura de gel de matriz, células vasculares, meio de cultura e reagente. A mistura foi então injetada por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu e aquecida usando uma almofada de aquecimento para acelerar sua coagulação e, finalmente, formar plugue de gel. A Figura 2A é o fluxograma para indicar vasos com dextrano marcado fluorescente. O dextran fluorescente marcado f…

Discussion

Apresentamos um método confiável e conveniente para a avaliação quantitativa da angiogênese in vivo sem coloração. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu para formar plugue de gel (Figura 1). Após 7 dias da formação do plugue de gel, o dextran-FITC foi injetado por via intravenosa e circulado por 30…

Materials

Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF