Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

Summary

El método aquí presentado puede evaluar el efecto de los reactivos sobre la angiogénesis o la permeabilidad vascular in vivo sin tinción. El método utiliza la inyección de dextrano-FITC a través de la vena de la cola para visualizar los neovasos o la fuga vascular.

Abstract

Se han desarrollado varios modelos para investigar la angiogénesis in vivo. Sin embargo, la mayoría de estos modelos son complejos y costosos, requieren equipos especializados o son difíciles de realizar para su posterior análisis cuantitativo. En este trabajo se presenta un ensayo de tapón de gel de matriz modificada para evaluar la angiogénesis in vivo. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia o ausencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la espalda de los ratones receptores. Después de 7 días, se inyecta solución salina tampón fosfato que contiene dextrano-FITC a través de la vena de la cola y se hace circular en los vasos durante 30 min. Los tapones de gel de matriz se recogen y se incrustan con gel de inclusión de tejido, luego se cortan secciones de 12 μm para la detección de fluorescencia sin tinción. En este ensayo, el dextrano-FITC con alto peso molecular (~150.000 Da) se puede utilizar para indicar los vasos funcionales para detectar su longitud, mientras que el dextrano-FITC con bajo peso molecular (~4.400 Da) se puede utilizar para indicar la permeabilidad de los neovasos. En conclusión, este protocolo puede proporcionar un método fiable y conveniente para el estudio cuantitativo de la angiogénesis in vivo.

Introduction

La angiogénesis, el proceso de formación de neovasos a partir de vasos preexistentes, desempeña un papel fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, el desarrollo tumoral, etc.1,2,3,4,5. Este proceso dinámico involucra varias etapas, incluyendo la degradación de la matriz, la proliferación de células vasculares, la migración y autoorganización para formar estructuras tubulares y la estabilización de los neovasos⁶. Se ha demostrado que la promoción de la angiogénesis es fundamental en el tratamiento del infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular y otros tipos de enfermedades isquémicas⁷, mientras que la inhibición de la angiogénesis se ha considerado una estrategia prometedora en el tratamiento de cánceres⁸ y enfermedades reumatoides9. La angiogénesis ha sido considerada como un principio organizador para el descubrimiento de fármacos¹⁰. Por lo tanto, la construcción de un método confiable y conveniente para evaluar el alcance de la angiogénesis es fundamental para la investigación mecánica o el descubrimiento de fármacos en enfermedades dependientes de angiogénesis.

Se han desarrollado varios modelos in vitro e in vivo para evaluar la angiogénesis¹¹. Entre estos, los modelos bidimensionales (2-D), como el ensayo de formación de tubos de gel^{de matriz 12}, no pueden formar estructuras tubulares funcionales. Los modelos animales, como el modelo de isquemia de las extremidades posteriores^13,14, pueden reproducir el proceso de angiogénesis, pero son complejos y requieren un sistema de imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser. Los modelos 3D de morfogénesis vascular, como el ensayo de tapón de gel de matriz, proporcionan una plataforma simple que puede imitar el proceso de angiogénesis in vivo¹⁵, pero la detección de angiogénesis requiere inmunohistoquímica o tinción de inmunofluorescencia 16,17,18, que son variables y poco visualizadas.

Aquí, describimos un protocolo para un ensayo de tapón de gel de matriz modificada en el que las células vasculares se mezclaron con gel de matriz y se inyectaron subcutáneamente en la parte posterior de ratones para formar un tapón. En el tapón, las células vasculares necesitan degradar la matriz, proliferar, migrar y autoorganizarse para finalmente formar vasos funcionales con flujo sanguíneo en el entorno interno. A partir de entonces, se inyecta dextrano marcado con fluorescencia a través de la vena de la cola, para fluir a través del tapón, y la etiqueta se visualiza para indicar neovasos. El contenido de angiogénesis puede evaluarse cuantitativamente por la longitud de los vasos. Este método puede formar vasos funcionales que no se pueden producir en modelos de angiogénesis 2D¹², y no necesita un proceso de tinción complejo como en el ensayo de tapón de gel de matriz ordinario¹¹. Tampoco requiere instrumentos específicos costosos como el sistema de imágenes de flujo sanguíneo moteado con láser en la isquemia de las extremidades posteriores modelo 13,14,19. Este método es versátil, de bajo costo, cuantificable y fácil de realizar, y puede utilizarse para determinar la capacidad proangiogénica o antiangiogénica de los fármacos o utilizarse en la investigación mecánica implicada en la angiogénesis.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19 de julio de 2021). Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Tabla de materiales. 1. Preparación del medio de cultivo Medio de cultivo 10x M199: Disolver el polvo de M199 a una concentración de 10x con 90 mL de agua desionizada y agregar 10 mL…

Representative Results

La Figura 1 es el diagrama de flujo que muestra cómo preparar la mezcla de gel de matriz, células vasculares, medio de cultivo y reactivo. A continuación, la mezcla se inyectó por vía subcutánea en la espalda de ratones Nu/Nu y se calentó con una almohadilla térmica para acelerar su coagulación y finalmente formar un tapón de gel. La Figura 2A es el diagrama de flujo para indicar los vasos con dextrano marcado con fluorescen…

Discussion

Presentamos un método fiable y conveniente para la evaluación cuantitativa de la angiogénesis in vivo sin tinción. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones Nu/Nu para formar un tapón de gel (Figura 1). Después de 7 días de formación del tapón de gel, se inyectó dextran-FITC por vía intravenosa y se…

Materials

Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF