Modifierad in vivo matrisgelplugganalys för angiogenesstudier
Summary
Metoden som presenteras här kan utvärdera effekten av reagenser på angiogenes eller vaskulär permeabilitet in vivo utan färgning. Metoden använder dextran-FITC-injektion via svansvenen för att visualisera neo-kärl eller vaskulärt läckage.
Abstract
Flera modeller har utvecklats för att undersöka angiogenes in vivo. De flesta av dessa modeller är dock komplexa och dyra, kräver specialutrustning eller är svåra att utföra för efterföljande kvantitativ analys. Här presenterar vi en modifierad matrisgelpluggsanalys för att utvärdera angiogenes in vivo. I detta protokoll blandades vaskulära celler med matrixgel i närvaro eller frånvaro av pro-angiogena eller antiangiogena reagenser och injicerades sedan subkutant i ryggen på mottagarmöss. Efter 7 dagar injiceras fosfatbuffertsaltlösning innehållande dextran-FITC via svansvenen och cirkuleras i kärl i 30 minuter. Matrix-gelpluggar samlas in och bäddas in med vävnadsinbäddningsgel, sedan skärs 12 μm sektioner för fluorescensdetektering utan färgning. I denna analys kan dextran-FITC med hög molekylvikt (~150 000 Da) användas för att indikera funktionella kärl för att detektera deras längd, medan dextran-FITC med låg molekylvikt (~4 400 Da) kan användas för att indikera permeabiliteten hos neokärl. Sammanfattningsvis kan detta protokoll ge en tillförlitlig och bekväm metod för kvantitativ studie av angiogenes in vivo.
Introduction
Angiogenes, processen för bildning av neo-kärl från redan existerande kärl, spelar en avgörande roll i många fysiologiska och patologiska processer, såsom embryonal utveckling, sårläkning, åderförkalkning, tumörutveckling, etc.1,2,3,4,5. Denna dynamiska process involverar flera steg, inklusive nedbrytning av matrisen, vaskulär cellproliferation, migration och självorganisering för att bilda rörformiga strukturer och stabilisering av neo-kärlen6. Att främja angiogenes har visat sig vara avgörande vid behandling av hjärtinfarkt, stroke och andra typer av ischemiska sjukdomar7 medan hämning av angiogenes har ansetts vara en lovande strategi vid behandling av cancer8 och reumatiska sjukdomar9. Angiogenes har ansetts vara en organiserande princip för läkemedelsupptäckt10. Således är konstruktionen av en tillförlitlig och bekväm metod för att bedöma omfattningen av angiogenes avgörande för mekanisk forskning eller läkemedelsupptäckt vid angiogenesberoende sjukdomar.
Flera in vitro– och in vivo-modeller har utvecklats för att utvärdera angiogenes11. Bland dessa kan tvådimensionella (2-D) modeller, som matrisgelrörsbildningsanalys12, inte bilda funktionella rörformiga strukturer. Djurmodellerna, såsom bakbensischemi modell13,14, kan reproducera angiogenesprocessen men är komplexa och kräver ett laserfläckigt blodflödesavbildningssystem. 3D-modeller av vaskulär morfogenes, som matrisgelplugganalys, ger en enkel plattform som kan efterlikna processen för angiogenes in vivo15, men detektionen av angiogenes kräver immunhistokemi eller immunofluorescensfärgning 16,17,18, som är variabla och dåligt visualiserade.
Här beskriver vi ett protokoll för en modifierad matrisgelpluggsanalys där vaskulära celler blandades med matrisgel och subkutant injicerades i ryggen på möss för att bilda en plugg. I pluggen måste kärlceller bryta ner matrisen, föröka sig, migrera och självorganisera sig för att slutligen bilda funktionella kärl med blodflöde i den inre miljön. Därefter injiceras fluorescerande märkt dextran via svansvenen, för att flöda genom pluggen, och etiketten visualiseras för att indikera neo-kärl. Innehållet av angiogenes kan utvärderas kvantitativt genom kärlens längd. Denna metod kan bilda funktionella kärl som inte kan produceras i 2-D angiogenesmodeller12 och behöver inte komplex färgningsprocess som i vanlig matrisgelplugganalys11. Det kräver inte heller dyra specifika instrument som laserspeckel blodflödesavbildningssystem i bakbensischemi modell 13,14,19. Denna metod är mångsidig, billig, kvantifierbar och lätt att utföra, och kan användas för att bestämma den pro- eller antiangiogena förmågan hos läkemedel eller användas i mekanisk forskning som är involverad i angiogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar en tillförlitlig och bekväm metod för kvantitativ utvärdering av angiogenes in vivo utan färgning. I detta protokoll blandades vaskulära celler med matrixgel i närvaro av pro-angiogena eller antiangiogena reagenser och injicerades sedan subkutant i ryggen på Nu/Nu-möss för att bilda gelplugg (Figur 1). Efter 7 dagars gelpluggsbildning injicerades dextran-FITC intravenöst och cirkulerades i 30 minuter. Gelpluggen samlades in och bäddades in med vävnadsinb?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H020005) och National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
