Модифицированный матричный гель-пробка in vivo для исследований ангиогенеза
Summary
Представленный здесь метод позволяет оценить влияние реагентов на ангиогенез или проницаемость сосудов in vivo без окрашивания. Метод использует инъекцию декстрана-FITC через хвостовую вену для визуализации неососудов или сосудистой утечки.
Abstract
Было разработано несколько моделей для исследования ангиогенеза in vivo. Однако большинство из этих моделей сложны и дороги, требуют специализированного оборудования или сложны в выполнении для последующего количественного анализа. Здесь мы представляем модифицированный матричный гель-пробка для оценки ангиогенеза in vivo. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии или отсутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей-реципиентов. Через 7 дней через хвостовую вену вводят фосфатный солевой раствор, содержащий декстран-ФИТК, и циркулируют в сосудах в течение 30 мин. Матричные гелевые пробки собираются и помещаются в тканевый гель для встраивания, затем нарезаются срезы по 12 мкм для обнаружения флуоресценции без окрашивания. В этом анализе декстран-FITC с высокой молекулярной массой (~150 000 Да) может быть использован для обозначения функциональных сосудов для определения их длины, в то время как декстран-ФИТК с низкой молекулярной массой (~4 400 Да) может быть использован для обозначения проницаемости неососудов. В заключение можно сказать, что данный протокол может обеспечить надежный и удобный метод количественного изучения ангиогенеза in vivo.
Introduction
Ангиогенез, процесс образования новых сосудов из ранее существовавших сосудов, играет важнейшую роль во многих физиологических и патологических процессах, таких как эмбриональное развитие, заживление ран, атеросклероз, развитие опухолей и т.д.1,2,3,4,5. Этот динамический процесс включает в себя несколько этапов, включая деградацию матрикса, пролиферацию сосудистых клеток, миграцию и самоорганизацию для формирования трубчатых структур и стабилизацию новых сосудов6. Было продемонстрировано, что стимулирование ангиогенеза имеет решающее значение при лечении инфаркта миокарда, инсульта и других видов ишемическихзаболеваний7, в то время как ингибирование ангиогенеза считается перспективной стратегией в лечениирака8 и ревматоидных заболеваний9. Ангиогенез считается организующим принципом для открытия лекарств10. Таким образом, создание надежного и удобного метода оценки степени ангиогенеза имеет решающее значение для механических исследований или разработки лекарств при ангиогенез-зависимых заболеваниях.
Для оценки ангиогенеза было разработано несколько моделей in vitro и in vivo 11. Среди них двумерные (2-D) модели, такие как матричная гелевая трубка12, не могут формировать функциональные трубчатые структуры. Животные модели, такие как модель ишемии задних конечностей 13,14, могут воспроизводить процесс ангиогенеза, но сложны и требуют лазерной системы визуализации кровотока. 3D-модели морфогенеза сосудов, такие как матричный гель-пробка, предоставляют простую платформу, которая может имитировать процесс ангиогенеза in vivo15, но для обнаружения ангиогенеза требуется иммуногистохимия или иммунофлуоресцентное окрашивание 16,17,18, которые являются вариабельными и плохо визуализируются.
Здесь мы опишем протокол модифицированного анализа матричной гелевой пробки, при котором сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем и подкожно вводили в заднюю часть мышей для формирования пробки. В пробке сосудистые клетки должны разрушать матрикс, пролиферировать, мигрировать и самоорганизовываться, чтобы, наконец, сформировать функциональные сосуды с током крови во внутренней среде. После этого флуоресцентно меченый декстран вводится через хвостовую вену, чтобы протекать через пробку, и метка визуализируется, чтобы указать на неососуды. Содержание ангиогенеза можно количественно оценить по длине сосудов. Этот метод может формировать функциональные сосуды, которые не могут быть получены в 2-D моделях ангиогенеза12, и не требует сложного процесса окрашивания, как в обычном матричном гелевом пробке11. Он также не требует дорогостоящих специальных инструментов, таких как лазерная система визуализации кровотока при ишемии задних конечностей модели 13,14,19. Этот метод является универсальным, недорогим, поддающимся количественной оценке и простым в исполнении, и может быть использован для определения про- или антиангиогенной способности лекарств или может быть использован в механических исследованиях, участвующих в ангиогенезе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлен надежный и удобный метод количественной оценки ангиогенеза in vivo без окрашивания. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu с образованием гел?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY22H020005) и Национальным фондом естественных наук Китая (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
