Questo protocollo descrive la coltura cellulare di neuroni dopaminergici del mesencefalo umano, seguita da colorazione immunologica e generazione di profili fenotipici neuronali da immagini microscopiche acquisite ad alto contenuto che consentono l'identificazione di variazioni fenotipiche dovute a modulazioni genetiche o chimiche.
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Articolo metodologico
Profilo fenotipico dei neuroni dopaminergici del mesencefalo derivati da cellule staminali umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il morbo di Parkinson (PD) è legato a una serie di processi biologici cellulari che causano la perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA). Molti attuali modelli cellulari di PD in vitro mancano di complessità e non tengono conto di fenotipi multipli. Il profilo fenotipico nei neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) può affrontare queste carenze misurando simultaneamente una serie di fenotipi neuronali in un tipo di cellula rilevante per la PD in parallelo. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere e analizzare i profili fenotipici da neuroni mDA umani disponibili in commercio. Un pannello di colorazione fluorescente specifico per i neuroni viene utilizzato per visualizzare i fenotipi correlati alla proteina nucleare, alla α-sinucleina, alla tirosina idrossilasi (TH) e alla proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2). Il protocollo di profilazione fenotipica descritto è scalabile in quanto utilizza piastre a 384 pozzetti, manipolazione automatica dei liquidi e microscopia ad alto rendimento. L'utilità del protocollo è esemplificata utilizzando neuroni mDA donatori sani e neuroni mDA portatori della mutazione G2019S legata al PD nel gene della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina (LRRK2). Entrambe le linee cellulari sono state trattate con l'inibitore della chinasi LRRK2 PFE-360 e sono stati misurati i cambiamenti fenotipici. Inoltre, dimostriamo come i profili fenotipici multidimensionali possano essere analizzati utilizzando metodi di classificazione supervisionati basati sul clustering o sull'apprendimento automatico. Il protocollo descritto interesserà in particolare i ricercatori che lavorano sulla modellazione delle malattie neuronali o che studiano gli effetti dei composti chimici nei neuroni umani.
Introduzione
Una varietà di processi biologici cellulari sono disturbati nella malattia di Parkinson (PD). Ad esempio, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo, i difetti di degradazione delle proteine, l'interruzione del traffico vescicolare e la funzione endolisosomiale sono stati associati alla perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA), sono comunemente osservati nella PD1. Pertanto, la malattia di Parkinson sembra coinvolgere molteplici meccanismi patologici che possono interagire e peggiorarsi a vicenda. Un modo utile per studiare questa interazione meccanicistica è la creazione di un'impronta digitale fenotipica completa o di un....
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Protocollo
1. Preparazione del terreno e delle piastre per la semina dei neuroni (Giorno 1)
- Per preparare le piastre per la semina dei neuroni il giorno 1, riscaldare la laminina a temperatura ambiente (RT) appena prima dell'uso. Preparare la soluzione di Laminina diluendo la soluzione madre di Laminina (0,1 mg/mL) 1/10 in PBS+/+ freddo (con Ca 2+ e Mg2+).
NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nell'Indice dei materiali. Le composizioni delle soluzioni e dei tamponi sono descritte nelle Tabelle 1-4. - Quindi, aggiungere 25 μL della soluzione di Laminina a ciascun pozzetto di una piastra a....
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Risultati
La profilazione fenotipica nei neuroni mDA è un modo efficiente per quantificare molteplici aspetti della biologia cellulare e i loro cambiamenti durante la modulazione sperimentale. Per esemplificare questa metodologia, questo studio ha fatto uso di neuroni LRRK2 G2019S crioconservati e mDA di donatori sani. Questi neuroni sono stati differenziati per circa 37 giorni, sono marcatori neuronali post-mitotici ed espressi (TUBB3 e MAP2) e marcatori neuronali dopaminergici, tra cui la tirosina idrossilasi (TH) in combinazion.......
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Discussione
La profilazione fenotipica è una tecnica per misurare un gran numero di fenotipi nelle cellule applicando colorazioni fluorescenti, microscopia e analisi delle immagini3. I profili fenotipici possono essere ottenuti e confrontati tra linee cellulari o altre condizioni sperimentali per comprendere i cambiamenti complessi nella biologia cellulare che potrebbero passare inosservati quando si utilizza una singola lettura. Qui descriviamo l'applicazione del profilo fenotipico ai neuroni mDA umani deriv.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori sono dipendenti di Ksilink.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi di Ksilink per il loro prezioso aiuto e le discussioni che hanno portato alla progettazione del protocollo presentato.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-pollo – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescenza |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescenza |
| Anti-topo - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescenza |
| Anti-coniglio - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescenza |
| Anti-tirosina Idrossilasi | Merck | T2928 | Immunofluorescenza |
| Anti-&alfa;-sinucleina | Abcam | 138501 Immunofluorescenza | |
| Piattaforma automatizzata per la manipolazione dei liquidi Bravo con testina 384ST | Agilent | Se non è disponibile un gestore di liquidi, si consiglia l'uso di una pipetta elettronica multicanale. | |
| Microscopio confocale | Yokogawa | CV7000 | Si consiglia l'uso di un microscopio a fluorescenza confocale automatizzato per garantire la coerenza della qualità dell'immagine. |
| Countess Contatore automatico di cellule | Invitrogen | Conteggio delle cellule prima della semina. Può essere fatto anche utilizzando una camera di conteggio manuale. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Tampone per lavaggio |
| EL406 Dispenser lavatrice | BioTek (Agilent) | Se non è disponibile un dispositivo di manipolazione dei liquidi, si consiglia l'uso di una pipetta elettronica multicanale. | |
| Soluzione di formaldeide (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fissazione prima della colorazione |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Colorazione nucleare |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base Medium per neuroni |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Donatore |
| apparentemente sanoiCell DPN, Donatore#11299, Fenotipo LRRK2 G2019S, fenotipo PD lotto#106139 | Fujifilm | C1149 | Donatore portatore della mutazione LRRK2 G2019S |
| Integratore iCell Nervous System | Fujifilm | M1031 | Supplemento per terreno base |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplemento per terreno base |
| Jupyter Python Notebook | interno | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook per eseguire la visualizzazione e la classificazione del profilo fenotipico a partire da dati grezzi. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Rivestimento per piastre |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | Inibitore della chinasi LRRK2 |
| PhenoLink | Sviluppo interno | Software per l'analisi delle immagini | |
| PhenoPlate 384w, rivestito in PDL | Perkin Elmer | 6057500 | Piastra pre-rivestita per coltura cellulare e imaging. Questa piastra consente l'imaging di tutti i pozzetti utilizzando tutti gli obiettivi del microscopio Yokogawa CV7000. |
| Piastre di stoccaggio Abgene 120 µ L | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessario per l'erogazione di composti utilizzando il sistema di pipettaggio Vprep. Se non disponibile, si consiglia l'uso di una pipetta elettronica multicanale. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilizzazione prima della lisi |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determinazione delle cellule viventi |
| Sistema di pipettaggio Vprep | Agilent | Medium cambio ed erogazione di composti. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta elettronica multicanale. |
Riferimenti
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....
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Ristampe e permessi
