التعبير الجيني المحوري في الخلايا المستزرعة باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي المؤتلف غير المنقى

Summary

يستخدم الفيروس الغدي المؤتلف (rAAV) على نطاق واسع لتوصيل الجينات السريرية وما قبل السريرية. الاستخدام الذي لا يحظى بالتقدير الكافي ل rAAVs هو النقل القوي للخلايا المستزرعة دون الحاجة إلى التنقية. بالنسبة للباحثين الجدد في rAAV ، نقدم بروتوكولا لاستنساخ كاسيت الجينات المحورة ، وإنتاج ناقلات الخام ، ونقل زراعة الخلايا.

Abstract

يمكن للنواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي المؤتلف (rAAV) أن تحقق تعبيرا قويا ودائما عن جين التحوير دون التكامل في مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة ، مما يجعلها خيارا شائعا لتوصيل الجينات في النماذج الحيوانية وفي البيئات السريرية. بالإضافة إلى التطبيقات العلاجية ، تعد rAAVs أداة مختبرية مفيدة لتوصيل جينات التحوير المصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات التجريبية للباحث والأهداف العلمية في الخلايا المزروعة. تتضمن بعض الأمثلة جينات المراسل الخارجية ، وأشرطة الإفراط في التعبير ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والأدوات القائمة على كريسبر ، بما في ذلك تلك الخاصة بشاشات الجينوم الواسعة. تعتبر عمليات نقل rAAV أقل ضررا للخلايا من التثقيب الكهربائي أو النقل الكيميائي ولا تتطلب أي معدات خاصة أو كواشف باهظة الثمن لإنتاجها. يمكن إضافة المحللات الخام أو الوسائط المكيفة التي تحتوي على rAAVs مباشرة إلى الخلايا المستزرعة دون مزيد من التنقية لتحويل العديد من أنواع الخلايا – وهي ميزة لا تحظى بالتقدير الكافي ل rAAVs. هنا ، نقدم بروتوكولات لاستنساخ كاسيت الجينات المحورة الأساسية ونوضح كيفية إنتاج وتطبيق مستحضرات rAAV الخام على الخلايا المستزرعة. كدليل على المبدأ ، نثبت نقل ثلاثة أنواع من الخلايا لم يتم الإبلاغ عنها بعد في تطبيقات rAAV: خلايا المشيمة ، الأرومات العضلية ، والكائنات العضوية المعوية الدقيقة. نناقش الاستخدامات المناسبة لمستحضرات rAAV الخام ، وقيود rAAVs لتوصيل الجينات ، واعتبارات اختيار القفيصة. يحدد هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة وفعالة للباحثين لتحقيق توصيل الحمض النووي المنتج في زراعة الخلايا باستخدام rAAV دون الحاجة إلى خطوات معايرة وتنقية شاقة.

Introduction

غالبا ما يتطلب توضيح القواعد الجزيئية للوظائف الخلوية التعبير عن الحمض النووي المعدل وراثيا في زراعة الخلايا. للتعبير عنها ، يجب أن تخترق جينات التحوير الغشاء الانتقائي للخلية وتصل إلى النواة ^1,2. لذلك ، فإن القدرة على تجاوز الحواجز المادية للخلية بشكل فعال والتلاعب بعملياتها المركزية هي ضرورة لتطبيق الجينات المحورة للكشف عن ظواهر بيولوجية جديدة. يستفيد أحد الأساليب من القدرة الجوهرية للفيروسات على^{توصيل الحمض النووي} الأجنبي ^3,4 والتعبير عنه.

الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) هو واحد من أصغر فيروسات الثدييات: يحتوي جينوم الحمض النووي أحادي الشريط الذي يبلغ حجمه 4.7 كيلو قاعدة (kb) على جينين ، rep (للتكرار) وغطاء (للقفيصة) ، معبأ داخل قفيصة 60-mer icosahedral قياس 25 نانومتر. تحتوي جينات rep / cap على العديد من المروجين وإطارات القراءة ومنتجات لصق التي تشفر ما لا يقل عن تسعة بروتينات فريدة مطلوبة لتكاثر الفيروس وإنتاجه وتعبئته ^5,6. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي كلا طرفي الجينوم على هياكل ثانوية تسمى التكرارات الطرفية المقلوبة (ITRs) الضرورية لتكرار الحمض النووي وتغليف الجينوم والمعالجة النهائية أثناء النقل⁷،^8،9،10. ولوائح الاتصالات الدولية هي عناصر الحمض النووي الوحيدة اللازمة لتعبئة الجينوم في القفيصة، وبالتالي يمكن استنساخ AAV لأغراض توصيل الجينات المحورة عن طريق استبدال جينات الممثل/الغطاء الفيروسي باختيار الباحث للعناصر التنظيمية و/أو الجينات ذات الأهمية⁶. يستخدم AAV المؤتلف الناتج (rAAV) ، مع جينوم ناقل مهندس (VG) ، على نطاق واسع في عيادة العلاج الجيني البشري وقد حقق نجاحات¹¹. استخدام الناقل لا يحظى بالتقدير الكافي في المختبر. يمكن ل rAAVs تحقيق التعبير الجيني المحورة بكفاءة في الخلايا المستزرعة لتلبية الاحتياجات التجريبية للباحث¹².

الطريقة الأكثر شيوعا لإنتاج rAAV هي عن طريق نقل البلازميد الثلاثي إلى خلايا HEK293 أو 293T (الشكل 1). يحتوي البلازميد الأول، الذي يطلق عليه عادة بلازميد رابطة الدول المستقلة، على جين التحوير المطلوب المحاط بلوائح الاتصالات الدولية (pAAV). اعتمادا على التطبيق ، تتوفر بلازميدات رابطة الدول المستقلة ذات العناصر المشتركة ، مثل المروجين الأقوياء أو الأدوات القائمة على كريسبر ، للشراء. والثاني هو بلازميد pRep / Cap الذي يحتوي على جينات AAV rep و cap من النوع البري المقدمة في trans – أي على بلازميد منفصل غير ITR يحتوي على بلازميد يعبر عن العناصر التنظيمية والهيكلية التي تتفاعل بعد ذلك مع بلازميد رابطة الدول المستقلة – وبالتالي يسمى البلازميد المتحول. بالإضافة إلى إحاطة VG فعليا ، يؤثر القفيصة على الانتحاء الخلوي^12,13. من خلال توفير جين الغطاء الخاص بالنمط المصلي في trans ، يمكن للباحثين بسهولة زيادة كفاءة النقل إلى أقصى حد عن طريق اختيار النمط المصلي القفيصة الأمثل للخلية المستهدفة المحددة. أخيرا ، باعتباره Dependoparvovirus ، يتطلب AAV فيروسا مساعدا لتنشيط تعبير rep / cap من المروجين الفيروسيين ، والذي تحققه الجينات المساعدة الفيروسية الغدية ، المقدمة على بلازميد ثالث مثل pAdΔF6^14,15. بعد 72 ساعة من انتقال البلازميد الثلاثي ، يمكن إطلاق الناقل من الخلايا المنتجة إلى وسط الاستزراع عن طريق دورات التجميد / الذوبان المتكررة. ثم يتم جمع محتويات اللوحة بأكملها ، ويتم إزالة الحطام الخلوي الكبير عن طريق الطرد المركزي ؛ طاف الوسائط الناتج هو إعداد rAAV خام جاهز لعمليات النقل النهائية.

الشكل 1: نظرة عامة على إنتاج ناقلات rAAV الخام. يمكن إنجاز إنتاج ونقل الخام rAAV في غضون 5 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قد يكون rAAV أكثر ملاءمة لتوصيل الجينات المحورة مقارنة بطرق النقل الأخرى ، والتي ترتبط عادة بالسمية الخلوية ، والكفاءة المنخفضة ، والكواشف والمعدات باهظة الثمن ، مثل التثقيب الكهربائي أو النقل الكيميائي / القائم على الدهون^16,17. يتجاوز rAAV هذه العقبات وغالبا ما يوفر تعبيرا قويا عن الجينات المحورة بأقل قدر من السمية ، والحد الأدنى من الوقت العملي. الأهم من ذلك ، أن إنتاج rAAV وتطبيقه في زراعة الخلايا أمر بسيط ونادرا ما يتطلب تنقية الناقل من وسائط الاستزراع (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، لا يدمج rAAV VG الخاص به في جينوم المضيف ، على عكس توصيل الجينات المحورة Lentiviral ، وبالتالي يقلل من خطر حدوث طفرات إدراجية¹⁸. على الرغم من الفوائد المحتملة لاستخدام rAAV لتوصيل الجينات المحورة ، يجب مراعاة القيود. والأهم من ذلك، ينبغي ألا يتجاوز حجم جين التحوير، بما في ذلك لوائح الاتصالات الدولية، 4,9 كيلو بايت بسبب القيود المادية للقفيصة، مما يحد من قدرة الباحث على تقديم عناصر تنظيمية كبيرة وجينات محورة بشكل فعال. علاوة على ذلك ، نظرا لأن rAAV هو فيروس غير متكامل ، فإن النقل يؤدي إلى تعبير جين التحوير العابر في الخلايا المنقسمة وقد لا يكون عمليا للتعبير المستقر. ومع ذلك ، يمكن استخدام الطرق التي تستخدم قوالب Cas9 المزدوجة التي يتم تسليمها بواسطة rAAV والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) لإدراج تسلسلات ثابتة في مواقع جينومية محددة إذا رغب الباحث^{في 19}.

Protocol

1. اكتساب البلازميد ملاحظة: سيقوم هذا البروتوكول باستنساخ جين مهم (GOI) إلى بلازميد يحتوي على ITR مع محفز الفيروس المضخم للخلايا (CMV) وتسلسل متعدد الأدنيل SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البلازميد دون مزيد من الاستنساخ لإنتاج rAAVs ، وتعبئة مراسل EGFP و Luciferase مزدوج مناسب. البلازميدات ذات العناصر التنظيمية المختلفة أو لتطبيقات مختلفة ، مثل التجارب القائمة على كريسبر ، متاحة على الإنترنت وستتبع خطوات استنساخ مماثلة لتلك الموجودة أدناه (انظر المناقشة للاطلاع على خطوات استنساخ إضافية). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام rep / cap ، أو trans ، البلازميدات لأنماط مصلية مختلفة – سيستخدم هذا البروتوكول rep / cap للنمط المصلي AAV 2. شراء طعنات بكتيرية تحتوي على بلازميد رابطة الدول المستقلة المحتوي على ITR ، وبلازميد مساعد للفيروس الغدي ، وبلازميد ممثل / غطاء ، وبلازميد يحتوي على حكومة إسرائيل. قم بخط البكتيريا على ألواح أجار فردية تحتوي على مضادات حيوية خاصة بمقاومة كل بلازميد. احتضان البكتيريا عند 30 درجة مئوية طوال الليل لتنمو.ملاحظة: إذا لم يكن البلازميد الذي يحتوي على GOI متاحا بسهولة للشراء ، فيمكن شراء جزء من الحمض النووي الاصطناعي (انظر جدول المواد) عبر الإنترنت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام جزء الحمض النووي الاصطناعي لتخطي عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بأكملها إذا رغبت في ذلك. اختر مستعمرة واحدة من كل صفيحة وازرعها في 3 مل من محلول Luria Bertani (LB) المكمل بالمضادات الحيوية المقابلة عند 30 درجة مئوية طوال الليل ، وتهتز عند 180 دورة في الدقيقة. نقل 1 مل من البكتيريا إلى دورق Erlenmeyer معقم 250 مل يحتوي على 50 مل من المخزن المؤقت LB المكمل بالمضادات الحيوية المقابلة. رج العبوة عند 30 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة طوال الليل. انقل البكتيريا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 3000 × جم ، درجة حرارة الغرفة. تجاهل طفا. اعزل البلازميد باستخدام مجموعة midiprep منخفضة السموم الداخلية أو خالية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.ملاحظة: لوائح الاتصالات الدولية هياكل غير مستقرة. لمنع حذف ITR أو حدوث طفرات ، يجب زراعة الخلايا البكتيرية عند 30 درجة مئوية لإبطاء الانقسام الخلوي وتخفيف الأخطاء في النسخ المتماثل. لزيادة غلة البلازميد ونقاوته ، تعتبر مجموعة midiprep أو maxiprep مثالية. يوصى باستخدام مجموعة منخفضة السموم الداخلية أو خالية من السموم الداخلية لتقليل تلوث الخلايا بالسموم الداخلية. ليس من الضروري إجراء عزل البلازميد داخل غطاء التدفق الصفحي ، حيث من غير المحتمل تلوث مستحضر البلازميد إذا تم إجراؤه على مقعد قياسي. 2. استنساخ الجين محل الاهتمام في البلازميد المحتوي على AAV ITR افتح خريطة البلازميد التي تحتوي على حكومة إسرائيل في برنامج عرض الحمض النووي.ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الدرج الكامل، بما في ذلك لوائح الاتصالات الدولية، 4,9 كيلوبايت بسبب قيود التغليف المادي للقفيصة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تحقيق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال لوائح الاتصالات الدولية بسبب الهياكل الثانوية. على هذا النحو ، لا ينصح بتجميع جيبسون لاستنساخ الجينات المحورة rAAV.انقر فوق علامة التبويب التسلسل للكشف عن التسلسل الكامل للبلازميد. قم بالتمرير إلى المنطقة الأكثر 5 بوصات من تسلسل GOI وانقر على النوكليوتيدات الأولى أثناء السحب إلى الداخل نحو جسم الجين لإنشاء برايمر أمامي. حرر بمجرد الوصول إلى درجة حرارة الانصهار (Tm) ~ 55 °C. انقر فوق التمهيدي إلى الأمام. قم بتضمين التسلسل يدويا لموقع تقييد EcoRI (5′ GAATTC 3′) في الطرف 5 ‘الأكثر من تسلسل التمهيدي. بالإضافة إلى ذلك ، أضف ست قواعد عشوائية إضافية في نهاية 5 ‘من موقع التقييد هذا للسماح للإنزيم بالتفاعل بكفاءة مع الحمض النووي. انقر على إضافة تمهيدي. ارجع إلى الشكل 2 للحصول على مثال تمثيلي. تحقق من التمهيدي للتأكد من أنه لا يمكن أن يشكل دبابيس الشعر أو دايمرات التمهيدي (باستثناء موقع التقييد الذي هو palindromic). إذا تشكلت دبابيس الشعر ، فقم بتغيير التسلسل العشوائي للقواعد الست الإضافية. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن البرايمر لا يرتبط في أي مكان آخر على البلازميد. كرر الخطوات لإنشاء برايمر عكسي في المنطقة الأكثر 3 ‘من GOI إلى الداخل إلى جسم الجين. انقر فوق التمهيدي العكسي وقم بتضمين موقع تقييد NotI (5 ‘GCGGCCGC 3’).ملاحظة: لا يمكن أن تحتوي حكومة إسرائيل على مواقع تقييد EcoRI أو NotI – إذا كان الأمر كذلك ، فستحتاج إلى استخدام إنزيمات تقييد مختلفة. تضخيم GOI في تفاعل تفاعل PCR سعة 50 ميكرولتر. استخدم المكونات الفردية المطلوبة من الجدول 1.ضع التفاعل في جهاز تدوير حراري واتبع معلمات الدورة من الجدول 2 للبرمجة. إذا كانت البادئات تحتوي على Tm مختلفة ، فاستخدم Tm السفلي للبرنامج. تحقق من تضخيم جزء PCR الصحيح عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من صبغة تحميل الهلام (6x) إلى 5 ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. قم بتشغيل سلم الحمض النووي وخليط تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز 0.8٪ يحتوي على بروميد الإيثيديوم وتصوره باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية.تنبيه: بروميد الإيثيديوم هو مطفر معروف. إذا ظهر شريط واحد محدد على الجل ، فقم بتنقية منتج PCR المتبقي في أنبوب شريط PCR باستخدام مجموعة تنظيف PCR القائمة على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إذا ظهرت نطاقات متعددة (بسبب تضخيم غير محدد) ، فقم باستئصال النطاق المطلوب ، وقم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. هضم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى وبلازميد العمود الفقري pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 في تفاعل 50 ميكرولتر مع المكونات الفردية المطلوبة من الجدول 3 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. مطلوب كمية أكبر من الحمض النووي البلازميد pAAV بسبب الانتعاش غير الفعال المتوقع بعد استخراج الهلام.ملاحظة: إنزيمات التقييد المستخدمة هي إصدارات عالية الدقة (HF). لا يمكن استخدام NotI العادي مع المخزن المؤقت CutSmart. إذا تم استخدام إنزيمات مختلفة ، فقد تكون هناك حاجة إلى درجة حرارة حضانة مختلفة ومخزن مؤقت.قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المهضوم باستخدام مجموعة تنظيف PCR القائمة على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحضير البلازميد الأساسي pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 المهضوم للرحلان الكهربائي الهلامي عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من صبغة تحميل الهلام (6x) إلى 50 ميكرولتر من تفاعل الهضم. قم بتحميل سلم الحمض النووي ، وتفاعل الهضم ، و 250 نانوغرام من البلازميد غير المهضوم (التحكم السلبي) على هلام الأغاروز 0.8٪ الذي يحتوي على بروميد الإيثيديوم مع آبار واسعة الأسنان. تصور مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، واستئصال الجزء المطلوب (~ 4.5 كيلو بايت) ، وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المهضوم وبلازميد العمود الفقري pAAV المهضوم في تفاعل ربط 20 ميكرولتر مع المكونات الفردية المطلوبة من الجدول 4. لحساب كمية منتجات PCR المطلوبة ، استخدم الصيغة 1. عادة ، استخدم نسبة مولية 3: 1 من منتج PCR (إدراج) إلى العمود الفقري (pAAV) ، بكتلة 50 نانوغرام العمود الفقري.فورمولا 1 قم بإجراء تحكم سلبي عن طريق استبدال منتج PCR بالماء. احتضان تفاعلات الربط عند 16 درجة مئوية طوال الليل ، أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. قم بإذابة قارورة من الخلايا البكتيرية المختصة التي تعاني من نقص إعادة التركيب (مثل خلايا Stbl3) على الثلج وضع 50 ميكرولتر في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 3 ميكرولتر من تفاعل الربط مباشرة على الخلايا واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة.ملاحظة: لوائح الاتصالات الدولية هياكل غير مستقرة وبالتالي تتطلب سلالات بكتيرية ناقصة التركيب للحد من أحداث حذف لوائح الاتصالات الدولية وإعادة تركيبها. يمكن استخدام خلايا DH5α بشكل متقطع للتكاثر (مرة أو مرتين) ولكن لا ينصح باستخدامها على المدى الطويل. وينبغي التحقق من سلامة لوائح الاتصالات الدولية بانتظام بعد تنقية midiprep.صدم البكتيريا بالحرارة في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ثم انقلها على الفور إلى الثلج لمدة 2 دقيقة. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت LB ورجه لمدة 1 ساعة عند 30 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة. انشر 125 ميكرولتر من الخليط على طبق أجار مع المضاد الحيوي المقابل واحتضانه طوال الليل (~ 18 ساعة) عند 30 درجة مئوية. اختر عدة مستنسخات وضع كل منها في أنبوب مزرعة بلاستيكي معقم يحتوي على 3 مل من LB يحتوي على المضاد الحيوي المقابل. احتضان الهز بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة.ملاحظة: لمنع حذف أو طفرات ITR ، يجب زراعة الخلايا البكتيرية عند 30 درجة مئوية لإبطاء الانقسام الخلوي وتخفيف الأخطاء في النسخ المتماثل. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي اختيار المستعمرات الأصغر لأن المستعمرات التي لا تملك لوائح الاتصالات الدولية قد تتمتع بميزة نمو على غيرها. ماصة 1.8 مل من كل مزرعة في أنبوب 2 مل وأجهزة طرد مركزي عند 6000 × جم لمدة 3 دقائق ، درجة حرارة الغرفة. اعزل الحمض النووي باستخدام مجموعة miniprep. قم بتخزين 1.2 مل المتبقية من المستنبتة في 4 درجات مئوية. تحقق من الاستنساخ الصحيح عن طريق تسلسل الحمض النووي أو هضم إنزيم تقييد التشخيص.ملاحظة: يوصى بتسلسل سانجر للإدخال، ولكن لا يمكن تحقيق العملية من خلال لوائح الاتصالات الدولية بالطرق القياسية. وينبغي التحقق من لوائح الاتصالات الدولية عن طريق ملخص القيود على النحو المبين أدناه. أضف 50 مل من المخزن المؤقت LB الذي يحتوي على المضاد الحيوي المقابل إلى دورق Erlenmeyer معقم سعة 250 مل. أضف 500 ميكرولتر من المستزرع المتبقي إلى القارورة ورجها عند 30 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلىOD 600 من 0.2-0.5 (~ 18 ساعة). انقل البكتيريا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 3000 × جم ، 4 درجات مئوية. عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة midiprep منخفضة السموم الداخلية أو الحرة. تحقق من سلامة ITR مع 20 ميكرولتر من هضم إنزيم تقييد التشخيص باستخدام XmaI (أو SmaI). تحضير تفاعل يحتوي على 500 نانوغرام بلازميد ، 0.5 ميكرولتر من الإنزيم ، و 1x عازلة ؛ احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تشغيل رد الفعل على 0.8 ٪ هلام أغاروز. إذا كانت لوائح الاتصالات الدولية سليمة ، فإن الهضم سيعطي نطاقا عند ~ 2.9 كيلو بايت ونطاقا آخر بحجم الكاسيت. وإذا لم يتم مراعاة هذا النطاق المميز، فقد لا تكون لوائح الاتصالات الدولية سليمة، وسيلزم إعادة الاستنساخ.ملاحظة: ستظهر على البلازميدات التي تحتوي على مواقع تقييد XmaI (أو SmaI) (بالإضافة إلى تلك الموجودة في لوائح الاتصالات الدولية) نطاقات إضافية. الشكل 2: مثال تمثيلي لتصميم التمهيدي. تصميم تمهيدي أمامي وخلفي لجين mScarlet (مثال تمثيلي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مبلغ مكون X ميكرولتر قالب الحمض النووي (25 نانوغرام) 1 ميكرولتر F التمهيدي (10 ميكرومتر) 1 ميكرولتر R التمهيدي (10 ميكرومتر) 1 ميكرولتر dNTP (10 مللي مول) 10 ميكرولتر العازلة Phusion (5x) 1 ميكرولتر فوسيون بوليميراز X ميكرولتر الماء 50 ميكرولتر المجلد النهائي الجدول 1: كواشف تضخيم PCR. المكونات المطلوبة لتفاعل PCR ناجح. درج درجة الحرارة الوقت التمسخ الأولي 98 درجة مئوية 1 دقيقة 30 دورة 98 درجة مئوية 10 ثانية Tm من التمهيدي 30 ثانية 72 درجة مئوية 30 ثانية لكل كيلوبايت التمديد النهائي 72 درجة مئوية 10 دقائق مسك 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى الجدول 2: برمجة تضخيم PCR. معلمات ركوب الدراجات المطلوبة لتفاعل PCR ناجح. مبلغ مكون X ميكرولتر منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (1 ميكروغرام) أو بلازميد pAAV (3 ميكروغرام) 5 ميكرولتر العازلة (10x) 1 ميكرولتر إيكوري-HF 1 ميكرولتر NotI-HF X ميكرولتر الماء 50 ميكرولتر المجلد النهائي الجدول 3: كواشف الهضم. المكونات المطلوبة لتفاعل هضم ناجح. مبلغ مكون X ميكرولتر إدراج (X نانوغرام) X ميكرولتر العمود الفقري (50 نانوغرام) 2 ميكرولتر T4 DNA Ligase Buffer (10x) 1 ميكرولتر T4 الحمض النووي ليجاز X ميكرولتر الماء 20 ميكرولتر المجلد النهائي الجدول 4: كواشف الربط. المكونات المطلوبة لتفاعل ربط ناجح. 3. إنتاج النواقل مع نقل البلازميد الثلاثي ملاحظة: تم تحسين القيم التالية لبئر واحد من صفيحة 6 آبار تنتج حجم تحضير خام نهائي يبلغ 2 مل. يمكن زيادة جميع القيم بمقدار 10 أضعاف للوحة 15 سم التي تنتج حجما نهائيا يبلغ 20 مل أو تصغيرها بمقدار 4 أضعاف للوحة 24 بئرا بحجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر. اصنع مخزونا قدره 1 ميكروغرام / ميكرولتر من البولي إيثيلين إنيمين هيدروكلوريد (PEI) MAX عن طريق إذابة 100 مجم من PEI MAX في 100 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.1 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. مرشح تعقيم الخليط مع مرشح 0.22 ميكرومتر وتجميد 1 مل القسمة عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. بمجرد إذابته ، قم بتخزين الكاشف لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية. بذرة 3 × 10 5 HEK293 أو HEK293T خلايا في صفيحة ذات 6 آبار مع وسط النسر المعدل من Dulbecco المسخن مسبقا (DMEM ،4.5 جم / لتر جلوكوز ، 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم) مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). تنمو إلى ~ 75٪ -90٪ التقاء في حاضنة محددة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 (الشكل 3).ملاحظة: لوحظ أن الخلايا المستزرعة بالبنسلين/الستربتومايسين (P/S) تقلل من إنتاجية النواقل. استخدام تقنية معقمة مناسبة يتجاوز الحاجة إلى استخدام P / S ، وبالتالي يوصى بعدم زراعة خلايا HEK293 بالمضادات الحيوية20. إذا كان P / S مطلوبا في عمليات النقل النهائية ، فمن المستحسن إضافة P / S إلى إعداد الخام بعد الحصاد. في أنبوب سعة 2 مل ، قم بإعداد خليط يحتوي على 1.3 ميكروغرام pAAV2 / 2 (Rep / Cap ، النمط المصلي 2) ، 1.3 ميكروغرام pAAV.GOI ، 2.6 ميكروغرام pAdΔF6 ، وخالية من المصل (SF) DMEM (4.5 جم / لتر جلوكوز ، 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم) في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر (انظر الجدول التكميلي 1 لإجراء حسابات مريحة). قم بإعداد عنصر تحكم سلبي في أنبوب منفصل عن طريق استبدال pRep / Cap بأي بلازميد غير ذي صلة. تمثل السيطرة السلبية بلازميد pAAV.GOI غير المعبأ الموجود في التحضير الخام الذي يمكن أن ينقل الخلايا أثناء النقل ، على الرغم من ندرته.ملاحظة: يعتبر الماكسيريب منخفض الذيفان الداخلي أو الخالي من البلازميد أو البلازميد المتوسط مثاليا للنقل الثلاثي وينتج بشكل عام ناقل عيار أعلى مقارنة بالحمض النووي المصغر ، على الرغم من أنه يمكن استخدام الحمض النووي المصغر للاختبار الأولي السريع والقذر. أضف 5.2 ميكرولتر من PEI MAX إلى خليط البلازميد ؛ هذا خليط بلازميد: PEI بنسبة 1: 1. تخلط جيدا عن طريق النبض 10-15 مرة على خلاط دوامة مضبوط على 7. إذا تم إنتاج مستحضرات متجهة متعددة ، أضف PEI إلى كل خليط بلازميد على فترات زمنية متداخلة مدتها دقيقة واحدة (أي التحضير 1 عند t = 0 دقيقة ، والتحضير 2 عند t = 1 دقيقة ، وما إلى ذلك) للسماح بتوقيت كاف لاستنشاق الآبار وتخفيف التفاعل في الخطوات التالية.ملاحظة: لوحظ أن نسبة 1: 1 من البلازميد: PEI هي الأمثل. ومع ذلك ، يمكن للمستخدمين الفرديين تحسين هذه النسبة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة. ارجع إلى المناقشة لمعرفة كيفية إجراء تحسين جزيرة الأمير إدوارد (انظر أيضا الجدول التكميلي 2). احتضان كل أنبوب لمدة 15 دقيقة بالضبط ثم قم بتخفيف التفاعل ب 1.9 مل من SF DMEM (4.5 جم / لتر جلوكوز ، 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم) للحصول على حجم نهائي قدره 2 مل. ماصة بلطف 2x لخلط. سيؤدي الخلط المفرط إلى تعطيل مجمعات البلازميد / PEI ويؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل. نضح الوسائط من البئر وأضف خليط البلازميد: PEI برفق على جوانب البئر لمنع الانفصال الخلوي. احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تحلل الخلايا وانفصالها أثناء الحضانة هو عملية طبيعية لإنتاج rAAV (الشكل 4). الشكل 3: خلايا HEK293 جاهزة للنقل. التقاء مثالي (75٪ -90٪) لخلايا HEK293 اللازمة لنقل البلازميد الثلاثي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: خلايا HEK293 بعد النقل. ظهور خلايا HEK293 قبل وبعد 1 أو 2 أو 3 أيام بعد النقل باستخدام pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 و pAAV2 / 2 و pAdΔF6 ونسبة 1: 1 من البلازميد: PEI. قضبان المقياس: 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 4. حصاد مستحضرات ناقلات النفط الخام قم بتجميد اللوحة الكاملة للخلايا المنقولة لمدة 30 دقيقة عند -80 درجة مئوية ، تليها ذوبان الجليد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. كرر لما مجموعه ثلاث دورات تجميد / ذوبان. لا تقم بإزالة الغطاء – يجب أن تظل اللوحة معقمة من الداخل. يمكن أن تظل الألواح عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة إلى الخطوات التالية.ملاحظة: تعمل الحاضنة غير المرطبة بشكل أفضل للذوبان ، مما يقلل من التكثيف على السطح الخارجي للألواح التي يمكن أن تؤدي إلى التلوث العرضي. نفذ الخطوتين التاليتين في غطاء التدفق الصفحي باستخدام تقنيات معقمة. امزج كل بئر عن طريق السحب لضمان أقصى قدر من الاضطراب للخلايا. انقل المحللة إلى أنبوب 2 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 15000 × جم ، درجة حرارة الغرفة لإزالة حطام الخلية. انقل بعناية المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2 مل. يمكن استخدام هذا المستحضر الخام على الفور دون معايرة أو تنقية. يمكن تخزين المتجه عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر أو -20 درجة مئوية لسنوات.ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن حساب التتر بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) عن طريق تحديد عدد الجينومات المتجهة (VG) داخل الجسيمات المقاومة للإنزيم DNase. على هذا النحو ، يتم إعطاء التتر بوحدات VG / mL. يجب إعادة معايرة النواقل المخزنة لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام حيث يمكن للناقل تجميع و / أو ربط جدران الأنبوب ، مما يقلل من عيار المستحضر. 5. النقل ضع نوع الخلية المطلوب (على سبيل المثال ، Huh7) في صفيحة 96 بئرا عند التقاء مستهدف بنسبة 50٪ -75٪ ، اعتمادا على مدة النقل. قد يؤدي الالتقاء الأكبر إلى انخفاض كفاءة نقل AAV. أضف متجه (على سبيل المثال ، CMV.mScarlet) إلى الخلايا دون معرفة عيار التحضير الخام للتطبيقات التي لا تكون فيها الجرعة ذات صلة ، مثل اختبار لوحة من القفيصات للتنبيغ في نوع خلية جديد. قم بإجراء سلسلة تخفيف 1: 3 من التحضير الخام في وسائط خالية من المصل (SF) للحصول على الكمية المثلى من المتجه المطلوب للتطبيق. نضح الوسائط من صفيحة 96 بئرا وأضف 50-100 ميكرولتر من تحضير الخام المخفف إلى الآبار. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.ملاحظة: قد يحتوي المصل على أجسام مضادة يمكنها تحييد ناقل AAV وتقليل كفاءة النقل. ومع ذلك ، يمكن استخدام المصل أثناء النقل لأنواع الخلايا الحساسة. قم بإزالة الناقل بعد 48 ساعة بعد النقل (hpt) واغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات قبل التسخين (PBS). يمكن أيضا إزالة النواقل واستبدالها بوسائط تحتوي على المصل بمجرد 2 hpt لأنواع الخلايا الحساسة. بالنسبة للعديد من التطبيقات ، قم بإجراء الحضانة الليلية لتحويل الخلايا واستبدال الآبار بوسائط جديدة تحتوي على مصل في الصباح. لا تتطلب أنواع الخلايا القوية ، مثل Huh7 و U2-OS ، تغيير الوسائط. قم بإنهاء النقل عن طريق تثبيت الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق. يمكن أيضا استخدام طرق إنهاء مختلفة بناء على التطبيق (على سبيل المثال ، التحلل). بالنسبة لمعظم أنواع الخلايا ، يحدث تعبير الذروة بمقدار 48 hpt وبالتالي فهو نقطة نهاية تجريبية شائعة. 6. الاختلافات في طريقة التنبيغ حسب نوع الخلية ملاحظة: تتطلب أنواع الخلايا المختلفة ظروف زراعة مختلفة. لذلك ، يجب تحسين إضافة متجه للتنبيغ بناء على احتياجات نوع الخلية. فيما يلي بروتوكولات نقل محددة للغاية لأنواع الخلايا المدرجة في النتائج التمثيلية ، مما يوضح بعض الاختلافات في بروتوكولات التنبيغ التي قد يرغب الباحث في تجربتها لتلبية احتياجاته الخاصة. الفأر العضوية المعوية الصغيرةاشتق عضويات معوية صغيرة للفأر (mSIOs) من إعداد سرداب معوي صغير من الفئران C57BL / 6J. قم بتضمين المواد العضوية في مصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 90٪ وثقافة في 24 لوحة بئر تحتوي إما على وسط نمو عضوي (بدون مضادات حيوية) أو وسط ما قبل النقل (50٪ وسط مكيف Wnt3a [يتم إنتاجه داخليا باستخدام خلايا L Wnt-3A في وسط نمو عضوي] ، 10 mM نيكوتيناميد ، مثبط 10 μM ROCK ، و 2.5 μM CHIR99021) لممر واحد (5-7 أيام) قبل النقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. قبل النقل ، اشطف المواد العضوية باستخدام D-PBS ، وقم بتعطيل قباب مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق السحب ، وفصل الكائنات العضوية إلى مجموعات خلايا صغيرة عن طريق حضنها في وسط تفكك لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية والمزيد من الماصات. أوقف عملية تفكك الخلايا عن طريق إضافة 5٪ FBS في DMEM / F-12 مع 15 mM HEPES ، ونقل مجموعات الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي وجمع مجموعات الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم ، درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق مجموعات الخلايا في وسط التنبيغ (وسط ما قبل النقل يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من البوليبرين أو وسط نمو عضوي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل بوليبرين) ونقلها إلى 48 لوحة بئر ، تليها إضافة مستحضرات خام AAV لتعبئة CMV.mScarlet للنقل. إجراء نقل المواد العضوية عن طريق الطرد المركزي للوحة لمدة 1 ساعة عند 600 × جم و 37 درجة مئوية ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات إضافية. اجمع المواد العضوية المحولة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 × جرام ، ودرجة حرارة الغرفة ، وضعها على الجليد. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق المواد العضوية المحولة في مصفوفة غشاء القاع بنسبة 90٪ في وسط ما قبل النقل أو وسط نمو عضوي وقطرات بذور تبلغ 20 ميكرولتر في بئر واحد من زجاج غطاء حجري تم تسخينه مسبقا. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق في الحاضنة ، قم بتضمين القطرة في 350 ميكرولتر من وسط ما قبل النقل أو وسط النمو العضوي واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. تحديد كفاءة التنبيغ بعد 2-5 أيام من التنبيغ عن طريق تصوير الكائنات العضوية المحولة على مجهر متحد البؤر وتقدير النسبة المئوية للخلايا الفلورية الحمراء لكل عضوي. خلايا بيووفي 24 ساعة قبل التنبيغ ، صفيحة سرطان المشيمة البشري BeWo الخلايا في 10000 خلية لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. تمييع الاستعدادات الخام AAV التعبئة CMV.mScarlet إلى 1: 1 في مصل F12-K BeWo المتوسطة حتى حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر. نضح الوسط من البئر واستبدله ب 50 ميكرولتر AAV مخفف لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل (~ 18 ساعة) ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط BeWo F12-K الذي يحتوي على 10٪ FBS لرفع الحجم الكلي إلى 150 ميكرولتر. احتضان الخلايا لمدة 6 ساعات إضافية لما مجموعه 24 ساعة بعد النقل (hpt). للتصوير ، قم بتلطيخ الخلايا الحية بصبغة Hoechst لمدة 30 دقيقة في وسط F12-K ، ثم استبدل الوسط ب DMEM الخالي من الفينول الذي يحتوي على 10٪ FBS ، وملحق 1x glutamax ، و 1x مكمل بيروفات الصوديوم للتصوير. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية على مجهر متحد البؤر باستخدام مجموعات مرشحات DAPI (لتصوير Hoechst) و mCherry (للتصوير القرمزي) مع 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. خلايا Hepa1-6 و Huh7صفيحة الفئران Hepa1-6 خلايا الكبد وخلايا الكبد البشرية Huh7 في DMEM (4.5 جم / لتر جلوكوز ، 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم ، 10٪ FBS) عند 5000 خلية لكل بئر من صفيحة 96 بئرا قبل 24 ساعة من النقل. أضف 50 ميكرولتر من مستحضرات AAV الخام غير المخففة التي تقوم بتعبئة CMV.mScarlet مباشرة إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. اغسل الخلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ، وثبتها في 4٪ PFA ، وصمة عار بصبغة Hoechst لمدة 10 دقائق. قم بإجراء التصوير على مجهر متحد البؤر باستخدام مجموعات مرشح DAPI (لتصوير Hoechst) و mCherry (للتصوير القرمزي). خلايا C2C12 و HSkMCصفيحة الفئران غير المتمايزة C2C12 myoblasts والخلايا العضلية الهيكلية الأولية البشرية غير المتمايزة (HSkMC) الخلايا العضلية عند 5000 خلية لكل بئر من صفيحة 96 بئرا ، قبل 72 ساعة من النقل. تمييع الاستعدادات AAV الخام التعبئة والتغليف CMV.mScarlet إلى 1: 1 في DMEM (4.5 جم / لتر جلوكوز ، Penn / Strep ، 20٪ FBS) للأرومات العضلية C2C12 أو وسائط نمو العضلات الهيكلية للأرومات العضلية HSkMC. التفريق بين الخلايا العضلية HSkMC والأنابيب العضلية عن طريق تغيير الوسائط إلى وسائط التمايز. احتضان الخلايا العضلية والأنابيب العضلية في مستحضرات AAV المخففة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بتلطيخ الخلايا الحية بصبغة Hoechst لمدة 10 دقائق وصورة على مجهر متحد البؤر باستخدام مجموعات مرشح DAPI (لتصوير Hoechst) و mCherry (للتصوير القرمزي).

Representative Results

العثور على القفيصة المثلى لتحويل الخلايا المستزرعة ذات الأهميةتم تحويل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا لتحديد انتحاء الأنماط المصلية المختلفة للقفيصة (الشكل 5). تم تعبئة الأنماط المصلية الطبيعية AAV214 و AAV4 21 و AAV5 22 و AAV8 23 و AAV924 ومتغيرات القفيصة الهندسية Anc80 25 و DJ 26 و LK03 27 وKP1 28 مع جينوم ناقل يعبر عن mScarlet تحت مروج CMV ، مستنسخ باستخدام الطرق المنصوص عليها في هذا البروتوكول. تم تخفيف المستحضرات الناقلة الخام غير المعايرة في وسط الاستزراع المناسب وتم تحويل الخلايا لمدة 24+ ساعة وتصويرها (الشكل 5B). تم حساب كفاءة النقل من خلال نسبة الخلايا الكلية التي كانت mScarlet + ، أو نسبة الخلايا في مستوى z واحد التي كانت mScarlet + (للعضويات المعوية الدقيقة للفأر ؛ الشكل 5 ج). لا يتم توفير كفاءات النقل (خلايا mScarlet +) للأنابيب العضلية C2C12 و HSkMC المتمايزة ، ولكن بدلا من ذلك للخلايا العضلية C2C12 و HSkMC غير المتمايزة (الشكل 5A). كان AAV2 و KP1 أقوى الأنماط المصلية عبر خطوط الخلايا التي تم اختبارها (الشكل 5A). ولوحظ أيضا أن أنواع الخلايا المماثلة التي تنشأ من أنواع مختلفة يتم تحويلها بكفاءة متفاوتة. على سبيل المثال ، يظهر Hepa1-6 (خط خلايا الكبد المشتق من مورين) انخفاضا ملحوظا في التنبيغ مقارنة ب Huh7 (خط خلايا الكبد المشتق من الإنسان) عند استخدام AAV2 (الشكل 5B). علاوة على ذلك ، تلعب ظروف الوسائط المختلفة دورا مهما أثناء النقل. تكون الكائنات العضوية المعوية الدقيقة للفأر (mSIOs) المستزرعة في وسائط ما قبل النقل أقل فعالية مقارنة بتلك المستزرعة في وسائط النمو العضوي (الشكل 5C). بالإضافة إلى ذلك ، يقوم AAV2 بتحويل الخلايا العضلية HSkMC غير المتمايزة والأنابيب العضلية HSkMC المتمايزة بكفاءة (الشكل 5B) ، على الرغم من صعوبة التحليل الكمي للأنابيب العضلية وبالتالي لا يتم توفيره. توضح كفاءات النقل العالية التي لوحظت لأنواع مختلفة من الخلايا في الشكل 5 أنه يمكن استخدام مستحضرات ناقلات الخام بشكل فعال لتحويل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا دون خطوات أخرى مثل التنقية والمعايرة. ومع ذلك ، ينبغي إيلاء اعتبار دقيق عند اختيار قفيصة لتحقيق أقصى قدر من توصيل الجينات المحورة. تم اختبار العديد من خطوط الخلايا والقفيصات الأخرى مسبقا وتم نشرها ، على الرغم من وجود مستحضرات ناقلات منقاة12. يمكن أن يؤثر التأثير المستقل للجسيم المتجه لظروف الوسائط على كفاءة النقل. ومع ذلك ، فمن المقبول عموما أن الانتحاء (أي الامتصاص النوعي لنوع الخلية والتعبير عن المتجه) هو خاصية محددة للقفيصة29. لم يلاحظ بعد أن المقارنة بين الخام المطابق للجرعة والمستحضرات المنقاة تؤثر على الانتحاء الخلوي. لذلك ، يمكن استخدام مستحضرات النواقل الخام بطريقة مماثلة للناقلات المنقاة في زراعة الخلايا. الشكل 5: نقل النواقل الخام لأنواع الخلايا المختلفة . (أ) النسبة المئوية ل mScarlet + بعد إضافة نواقل AAV مختلفة تحتوي على جين محوري mScarlet . (ب) الخلايا التي تعبر عن mScarlet المنبعثة من النمط المصلي AAV 2. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (Hepa1-6 و Huh7 و C2C12 و HSkMC) ، 200 ميكرومتر (BeWo) ، 20 ميكرومتر (mSIO). الاختصارات: hpt = ساعات بعد النقل. (ج) تم علاج العضويات المعوية الدقيقة للفأر (mSIOs) إما ب rAAV في وسائط ما قبل النقل أو وسط نمو عضوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول التكميلي 1: ورقة عمل نقل البلازميد الثلاثي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي 2: ورقة عمل تحسين جزيرة الأمير إدوارد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

استنساخ
لا يقتصر بروتوكول الاستنساخ على بلازميد pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 المستخدم أعلاه ويمكن تغييره بسهولة بناء على الاحتياجات التجريبية للباحث. ويتاح شراء العديد من البلازميدات المحتوية على لوائح الاتصالات الدولية بسهولة على الإنترنت. على سبيل المثال ، تتوفر البلازميدات التي تحتوي على كل من Cas9 وموقع استنساخ sgRNA ولكنها تتطلب خطوات إضافية قليلة مثل تلدين قليل النوكليوتيد ومعالجة PNK³⁰. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن العثور على البلازميدات التي تحتوي على موقع استنساخ متعدد (MCS) مع لوائح الاتصالات الدولية فقط وبدون عناصر تنظيمية داخلية³¹. إذا كان سيتم استخدام بلازميدات مختلفة ، فإن إنزيمات القطع (RE) المستخدمة في الهضم هي عادة العناصر الوحيدة التي قد تحتاج إلى تغيير في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن أحد قيود rAAV هو سعة الشحن المحدودة. ونظرا للقيود المادية للقفيصة، ينبغي ألا يتجاوز جينوم الناقل 4,9 كيلوبايت، بما في ذلك لوائح الاتصالات الدولية.

عند عزل البلازميد عن البكتيريا ، من الأهمية بمكان استخدام مجموعة midiprep أو maxiprep منخفضة السموم الداخلية أو خالية من الماكسيريب لتخفيف الضرر الذي يلحق بالخلايا أثناء نقل البلازميد الثلاثي أو التنبيث. غالبا ما تحتوي البلازميد من مجموعات miniprep على شوائب أعلى وتركيزات منخفضة وعدد أقل من الحمض النووي فائق الالتفاف ، وكلها يمكن أن تؤثر على الإنتاج النهائي ل rAAV وبالتالي لا ينصح به.

ومن الأهمية بمكان فهم هيكل لوائح الاتصالات الدولية وخصائصها أثناء الاستنساخ. أولا، من الصعب للغاية استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال لوائح الاتصالات الدولية. وينبغي تجنب تصاميم الاستنساخ التي تتطلب تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال لوائح الاتصالات الدولية، بالإضافة إلى الحد من استخدام تقنية استنساخ تجميع جيبسون. وعلى هذا النحو، فإن استنساخ إنزيمات التقييد هو الطريقة المفضلة للاستنساخ في البلازميدات المحتوية على لوائح الاتصالات الدولية. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون بعض البادئات لتسلسل سانجر متوافقة إذا كانت المنطقة المتسلسلة تحتوي على لوائح الاتصالات الدولية. وبدلا من ذلك، يوصى باستخدام الأعداد الأولية التي تتسلسل بعيدا عن لوائح الاتصالات الدولية وفي جسم الجينوم المتجه للحصول على نتائج تسلسل أكثر دقة. ثانيا، تكون لوائح الاتصالات الدولية عرضة للحذف وإعادة الترتيب والطفرات عند تحويلها إلى بكتيريا لتضخيم البلازميد^32,33. للتخفيف من هذه الأحداث ، يوصى باستخدام سلالات بكتيرية مختصة تعاني من نقص إعادة التركيب ، مثل Stbl3 ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لإبطاء الانقسامات الخلوية. وأخيرا، لوحظ أن المستعمرات الأصغر قد تتوافق مع الحيوانات المستنسخة دون إعادة ترتيب أو حذف، لأن المستعمرات التي لا تحتوي على لوائح الاتصالات الدولية قد تمنح ميزة نمو وتكون أكبر. لذلك ، يوصى باختيار مستعمرات صغيرة.

إنتاج النواقل
يمكن أن يتأثر الإنتاج الناجح لناقل rAAV بعناصر متعددة. أحد العوامل الحاسمة هو صحة خلايا HEK293 أو 293T المستخدمة في النقل. بشكل عام ، تعتبر أرقام المرور المنخفضة مثالية ، حيث قد تظهر الخلايا ذات المرور العالي اختلافات في النمط الجيني والنمط الظاهري يمكن أن تقلل من عيار rAAV. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون كثافة الخلايا المصنفة 75٪ -90٪ التقاء للإنتاج الفعال. تولد الخلايا المتناثرة غلات متجهة منخفضة نظرا لوجود عدد أقل من الخلايا المتاحة لإنتاج النواقل ، في حين أن الخلايا المتضخمة لن يتم نقلها بكفاءة.

تساهم الاختلافات بين الكثير من الكواشف ومخزون الخلايا والتباين العام من مختبر إلى مختبر في الاختلافات في كفاءة النقل وعيار الإنتاج. أحد العوامل القابلة للتحسين التي يمكن أن تؤدي إلى تحسينات العيار هو نسبة البلازميد: PEI في تفاعلات النقل. من الأهمية بمكان استخدام PEI MAX<. يوصى باستخدام نسبة البلازميد: PEI البالغة 1: 1 كنقطة انطلاق ، وإذا بدت كفاءة النقل أو التنبيغ ضعيفة ، فاختبر عدة نسب مختلفة. يكون تحسين العيار أسهل إذا كنت تستخدم جين التحوير مع قراءة مرئية ، مثل مراسل CMV.Luc.IRES.EGFP trangene المستخدم هنا كمواد أولية للاستنساخ. لإجراء التحسين ، اتبع خطوة البروتوكول 3 باستخدام لوحة 12 بئرا وتقليل كتل البلازميد وأحجام الكاشف بمقدار اثنين (كتلة البلازميد النهائية هي 2.6 ميكروغرام). اضبط حجم PEI وفقا لذلك ليتوافق مع النسب التي تتراوح من 1: 0.75 إلى 1: 3 ، مع زيادة الزيادات بمقدار 0.25 (الشكل 6). خفف كل تفاعل باستخدام 950 ميكرولتر من وسائط SF بعد 15 دقيقة. للراحة ، يمكن عمل مزيج رئيسي يحتوي على البلازميدات الثلاثية وسحبها بشكل فردي في أنابيب سعة 1.5 مل قبل إضافة PEI-see الملف التكميلي 2. حصاد المتجه ، وتحويل الخلايا ذات الأهمية ، والصورة. يتوافق البئر ذو أعلى كفاءة نقل (نسبة خلايا GFP +) مع أعلى عيار وأفضل نسبة من PEI: DNA.

الشكل 6: سير عمل تحسين جزيرة الأمير إدوارد. رسم تخطيطي للخطوات المطلوبة لتحسين جزيرة الأمير إدوارد. نسب متعددة من البلازميد: يتم اختبار جزيرة الأمير إدوارد لتحديد النسبة المثلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اعتبارات الحصاد والعيار
تعمل تقنية التجميد / الذوبان المستخدمة لحصاد ناقل rAAV على تحلل خلايا HEK293 بشكل فعال بطريقة متوافقة مع الاستخدام المباشر للمحللات الموضحة لتحويل الخلايا المستزرعة. يتم إطلاق بعض الأنماط المصلية rAAV ، مثل AAV1 و AAV8 و AAV9 من الخلايا أثناء إنتاج النواقل ويمكن حصادها من وسط الخلية المستزرع دون دورات التجميد / الذوبان³⁴. عادة ما تنتج الطريقة الموصوفة هنا عيارا بترتيب 1 × 10 10 VG / mL عند استخدام قفيصة AAV2 ، و 1 ×^{10 11} VG / mL ل AAV8. في حين يمكن تحقيق عيارات أعلى عن طريق المنظفات أو غيرها من التحلل الكيميائي ، إلا أنها ضارة بالخلايا في الاستخدام النهائي وتتطلب تنقية rAAVs من المحلل. العيار السفلي هو أحد المقايضات التي يجب على الباحث مراعاتها عند تحديد ما إذا كانت المستحضرات الخام مناسبة لاحتياجاته البحثية ، ومع ذلك ، فإن التتر المنخفض الهامشي الناتج عن الطرق الموضحة هنا يمكن أن يحول العديد من أنواع الخلايا بشكل جيد للغاية (انظر النتائج التمثيلية). بالإضافة إلى كفاءة النقل وصحة الخلية ، يختلف عيار النواقل اعتمادا على القفيصة المستخدمة أثناء إنتاج rAAV وحجم وتسلسل جين التحوير داخل VG³⁵.

عند حصاد مستحضرات النواقل الخام ، قد يكون الحمض النووي البلازميد الذي تم استخدامه أثناء نقل البلازميد الثلاثي موجودا ، وعلى الرغم من ندرته ، إلا أنه يؤدي إلى نقل المصب أثناء النقل. علاوة على ذلك ، قد ترتبط VGs غير المعبأة بالجزء الخارجي من القفيصات وتستدعي استجابة مناعية فطرية للحمض النووي العاري والأجنبي أحادي الشريط^36,37. لذلك ، قد تتطلب أنواع الخلايا الحساسة هضم مستحضرات النواقل DNase وتنقيتها لإزالة VGs والبلازميد غير المعبأة.

إذا رغب المرء في حساب عيار المستحضر الخام ، فيمكن إجراء qPCR لتحديد عدد VG المعبأة داخل الجسيمات المقاومة للإنزيم DNase (DRP). باختصار ، يتم هضم كمية صغيرة من المستحضر الخام DNase لإزالة الحمض النووي البلازميد ، أو تلويث الأحماض النووية ، أو VG المعبأ جزئيا. ثم تخضع العينة ل qPCR ويتم تحديد كمية VG المحمية داخل DRPs ، مما ينتج عنه عيار بوحدات جينوم متجه لكل مل من التحضير الخام³⁸. لا يوصى بإجراء معايرة متجهة باستخدام المقايسات المستندة إلى ELISA التي تحدد كمية التتر القفيصة. بالمقارنة مع فيروس AAV من النوع البري ، يعاني rAAV من نسبة من القفيصات الفارغة والمعبأة جزئيا³⁹. ستقوم ELISA بتحديد كمية جميع القفيصات بغض النظر عن محتويات الجينوم الخاصة بها وستبالغ في تقدير وحدات الطاقة القابلة للتحويل الموجودة في المستحضر ، الأمر الذي يتطلب VG معبأ.

اعتبارات النقل
هناك العديد من العوامل التي تؤثر على عمليات نقل rAAV ويجب وضع اعتبارات مناسبة لأي تجربة جديدة. اعتمادا على المروج الذي يقود التعبير الجيني ، يمكن أن يحدث بداية التعبير في وقت مبكر من 4 ساعات بعد النقل (hpt) ، ويتم تحقيق ذروة التعبير عادة بمقدار 48 hpt. من المهم أن تضع في اعتبارك المدة الزمنية من البذر الأولي للخلايا إلى نقطة النهاية التجريبية. هذا لتقدير التقاء بداية الخلايا والتأكد من أنها لا تنمو بشكل زائد بنهاية التجربة. إذا أصبحت الخلايا مفرطة في الالتقاء ، فقد يتغير السلوك الخلوي بسبب استجابة الإجهاد ويمكن أن يربك النتائج التجريبية. يمكن لبعض أنواع الخلايا ، مثل U2-OS ، تحمل فرط النمو / تثبيط الاتصال بشكل جيد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنهم تحمل فترات طويلة (48 ساعة +) في وسط مكيف خال من المصل – وهو نتاج بروتوكول الإنتاج هذا. ومع ذلك ، قد تتطلب أنواع الخلايا الحساسة إضافة مصل أو تخفيف المستحضر الخام مع وسط نمو خاص للحفاظ على الصحة أثناء النقل. تعد كفاءة النقل المنخفضة قليلا من استخدام الوسائط المحتوية على المصل مقايضة محتملة لصحة الخلايا ويجب أن يأخذها الباحث في الاعتبار.

عادة ، بالنسبة للخلايا سريعة الانقسام ، يكون التقاء البداية بنسبة 50٪ تقريبا هو الأمثل للتطبيقات التي سيتم إنهاؤها 48 hpt. ومع ذلك ، يمكن تعديل التقاء وفقا لذلك بناء على احتياجات التجربة. لا ينصح بتحويل خطوط الخلايا الخالدة من النوع أحادي الطبقة التي تزيد عن التقاء 75٪ بسبب انخفاض كفاءة النقل. يتم تحويل معظم أنواع الخلايا المستزرعة بنجاح وصحية بعد الحضانة الليلية باستخدام مستحضرات rAAV الخام ، يليها تغيير إلى الوسائط الطازجة المحتوية على المصل في الصباح.

يعد النمط المصلي للقفيصة عاملا مهما يجب مراعاته عند إنتاج rAAV لتحويل خلية مستهدفة ، حيث أن القفيصة هي المحدد الأساسي للانتحاء الخلوي والتعبير الجيني المحوري اللاحق¹³. AAV2 هو نمط مصلي يستخدم على نطاق واسع نظرا لقدرته على تحويل العديد من أنواع الخلايا المستزرعة بشكل فعال¹². يمكن أن تعزى خاصية AAV2 هذه إلى بروتيوغليكان كبريتات الهيبارين (HSPGs) الذي يعمل كعامل ارتباط أساسي ل AAV2 والمستويات العالية من HSPGs على الخلايا المستزرعة من التكيف إلى النمو في طبق⁴⁰. القفيصات الأخرى ، مثل AAV9 ، أقل فعالية في تحويل أنواع الخلايا الواسعة ويمكن تفسيرها من خلال عوامل ارتباط الاعتماد التي لم يتم التعبير عنها في هذا الإعداد⁴¹. لذلك ، نوصي باستخدام AAV2 كخيار أول قفيصة في الخلايا المستزرعة إذا لم يتم اختبار الخلية المستهدفة المرغوبة مسبقا باستخدام rAAV في الأدبيات.

يرجى ملاحظة أن أحد القيود الرئيسية على مستحضرات النواقل الخام هو أنها غير مناسبة لتحويل النماذج الحيوانية. تتطلب الدراسات في الجسم الحي تنقية المستحضرات والخضوع لتقييم الجودة.

التعبير الجيني التحوير واعتبارات التكامل المحتملة
لا تؤدي rAAVs بشكل موثوق إلى التعبير الدائم عن جين التحوير. بمرور الوقت ، يمكن إسكات VGs وقد يتم إغلاق التعبير المعدل وراثيا بعد عدة مقاطع⁴². بالإضافة إلى ذلك ، تظل غالبية VGs عرضية ، ولا تحتوي rAAVs على بروتينات Rep الفيروسية التي من شأنها أن تتوسط في الاندماج المتكرر في جينوم المضيف كما هو الحال في العدوى الفيروسية من النوع البري أو تعزز تكرار VGs⁴³. ونتيجة لذلك، ستضعف الحلقات في الخلايا المستحثة في النهاية بين الخلايا البنوية من خلال الانقسامات.

التكامل على المستوى القاعدي هو إمكانية لجميع مواد الحمض النووي المعدلة وراثيا التي يتم تسليمها. ومع ذلك ، فإن VGs المحتوية على ITR عرضة للتكامل بتردد أعلى⁴⁴. لذلك ، يمكن ملاحظة التعبير الدائم عن جين التحوير في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا. يجب على المستخدمين التفكير في هذا الاحتمال خاصة عند استخدام rAAV لتوصيل إنزيمات قطع الحمض النووي ، مثل Cas9 ، لأن الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل قد تؤدي إلى تكرار أكبر للتكامل والتعبير الدائم⁴⁵. في حين أن هذا يجعل rAAV مرشحا جيدا لتقديم قوالب إصلاح موجهة بالتماثل لوضع العلامات الداخلية أو إضافة الجينات ، يجب اعتبار إمكانية إدخال Cas9^19,46.

Materials

Snapgene DNA viewing sofrware	Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40	AddGene	105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)	AddGene	104963
pAdΔF6	AddGene	112867
LB Agar Carbenicillin	Sigma-Aldrich	L0418
Boekel Scientific Economy Digital Incubator	Boekel Scientific	133000
LB medium, powder	MP Biomedicals	113002042
Carbencillin (Disodium)	GoldBio	C-103-5
New Brunswick I26 Shaker	Eppendorf	M1324-0000
50 mL Centrifuge Tubes	Corning	430828
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit	Qiagen	12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS	USA Scientific	1402-3900
Mastercycler nexus	Eppendorf	6333000022
dNTP	Thermo Fisher Scientific	18427013
5x Phusion Buffer	NEB	B0518S	Provided with purchase of Phusion Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Gel Loading Dye, Orange (6X)	NEB	B7022S
DNA Clean & Concentrator-100	Zymo	D4029
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo	D4001
NotI-HF	NEB	R3189S
EcoRI-HF	NEB	R3101S
CutSmart Buffer (10x)	NEB	B6004S	Provided with purchase of restriction enzyme
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500100
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E1510
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer	NEB	B0202S	Provided with purchase of T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)	Eppendorf	22363204
Precision Microprocessor Water Bath	Thermo Scientific	51221046
Sterile Plastic Culture Tubes	Fisher Scientific	149566B
2.0 mL Microcentrifuge Tube	Thomas Scientific	1149Y01
ZR Plasmid Miniprep – Classic	Zymo	D4015
Xma1	NEB	R0180S
Sma1	NEB	R0141S
HEK 293T cells	ATCC	CRL-3216
Falcon 6-well	Corning	353046
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo-Fisher	11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator	Marshall Scientific	MCO-18AIC
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride)	Polysciences	24765-100
Mixer Vortex Genie 2	Electron Microscopy Sciences	102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer	Sanyo	14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 with transparent window	VWR	390-0384
Eppendorf Microcentrifuges	Eppendorf	05-400-005
Falcon 96-well	Corning	353072
C57BL/6J mice	JAX	strain #000664
organoid growth medium	STEMCELL Technologies	6005
L Wnt-3A cells	ATCC	CRL-2647
nicotinamide	Sigma	N0636-100G
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72052
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane	Fisher	356231
24-well plate	Fisher	08-772-1
D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-250
TrypLE Express	Fisher	12604013
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies	36254
polybrene	Millipore Sigma	TR-1003-G
48-well plates	Fisher	08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Fisher	12-565-470
BeWo cells	ATCC	CCL-98
F-12K Medium	ATCC	30-2004
Hepa1-6	ATCC	CRL-1830
Huh7	UC Berkeley BSD Cell Culture Facility	HUH-7
C2C12	ATCC	CRL-1772
HSkMC	ATCC	PCS-950-010
Skeletal Muscle Cell Growth Medium	Sigma	C-23060
Skeletal Muscle Differentiation Medium	Sigma	C-23061
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope	Fisher Scientific	12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14001000
PhenoPlate 96-well	Perkin Elmer	6055302
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red	Thermo-Fisher	31053028
GlutaMAX Supplement	Thermo-Fisher	35050079
Sodium Pyruvate	Thermo-Fisher	11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)	Addgene	104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)	Addgene	112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)	Addgene	130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)	Addgene	112865
pAnc80L65AAP	Addgene	92307
KP1 (rep/cap)			gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
LK03 (rep/cap)			gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
pAAV4 (rep/cap)			gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNA	Addgene	61591
pAAV.MCS	Addgene	46954
gBlock (synthetic DNA fragement)	IDT