Intradermal mikrodialyse: En tilgang til undersøgelse af nye mekanismer for mikrovaskulær dysfunktion hos mennesker

Summary

Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknik, der anvendes til at undersøge mikrovaskulær funktion i sundhed og sygdom. Både dosisrespons og lokale opvarmningsprotokoller kan anvendes til denne teknik til at udforske mekanismer for vasodilatation og vasokonstriktion i den kutane cirkulation.

Abstract

Den kutane vaskulatur er et tilgængeligt væv, der kan bruges til at vurdere mikrovaskulær funktion hos mennesker. Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknik, der anvendes til at undersøge mekanismer for vaskulær glat muskulatur og endotelfunktion i den kutane cirkulation. Denne teknik muliggør farmakologisk dissektion af patofysiologien af mikrovaskulær endoteldysfunktion som indekseret ved nedsat nitrogenoxidmedieret vasodilatation, en indikator for risiko for udvikling af hjerte-kar-sygdomme. I denne teknik placeres en mikrodialysesonde i hudens dermale lag, og en lokal varmeenhed med en laser Doppler flowmetrisonde placeres over sonden for at måle strømmen af røde blodlegemer. Den lokale hudtemperatur fastspændes eller stimuleres med direkte varmepåføring, og farmakologiske midler perfuseres gennem sonden for at stimulere eller hæmme intracellulære signalveje for at inducere vasodilatation eller vasokonstriktion eller for at forhøre interessemekanismer (co-faktorer, antioxidanter osv.). Den kutane vaskulære konduktans kvantificeres, og mekanismer for endoteldysfunktion i sygdomstilstande kan afgrænses.

Introduction

Kardiovaskulær sygdom (CVD) er den største dødsårsag i USA¹. Hypertension (HTN) er en uafhængig risikofaktor for slagtilfælde, koronar hjertesygdom og hjertesvigt og anslås at påvirke op til ~ 50% af USAs befolkning². HTN kan udvikle sig som en uafhængig CVD (primær HTN) eller som følge af en anden tilstand, såsom polycystisk nyresygdom og / eller endokrine lidelser (sekundær HTN). Bredden af HTN’s ætiologier komplicerer undersøgelser af de underliggende mekanismer og slutorganskader, der observeres med HTN. Der er behov for forskellige og nye forskningsmetoder til patofysiologien af slutorganskader forbundet med HTN.

Et af de tidligste patologiske tegn på CVD er endoteldysfunktion, som karakteriseret ved nedsat nitrogenoxid (NO)-medieret vasodilatation ^3,4,5. Flowmedieret dilatation er en almindelig tilgang, der anvendes til at kvantificere endoteldysfunktionen forbundet med CVD, men endoteldysfunktion i mikrovaskulære senge kan være både uafhængig af og forløber for store ledningsarterier ^6,7,8. Desuden påvirkes resistensarterioler mere direkte af lokalt væv end ledningsarterier og har mere øjeblikkelig kontrol over leveringen af iltrigt blod. Mikrovaskulær funktion er prædiktiv for uønsket kardiovaskulær hændelsesfri overlevelse ^9,10,11. Den kutane mikrovaskulatur er et tilgængeligt vaskulært leje, der kan bruges til at undersøge responser på fysiologiske og farmakologiske vasokonstriktive eller vasodilatoriske stimuli. Intradermal mikrodialyse er en minimalt invasiv teknik, hvis mål er at undersøge mekanismerne for både vaskulær glat muskel og endotelfunktion i den kutane mikrovaskulatur med målrettet farmakologisk dissektion. Denne metode står i kontrast til andre teknikker, såsom postokklusiv reaktiv hyperæmi, som ikke tillader farmakologisk dissektion, og iontoforese, som muliggør farmakologisk levering, men er mindre præcis i sin virkningsmekanisme (gennemgået grundigt andetsteds¹²).

Begrundelsen for udviklingen og anvendelsen af denne teknik gennemgås udførligt andetsteds¹³. Denne tilgang blev oprindeligt udviklet til brug i neurologisk forskning hos gnavere og blev derefter først anvendt på mennesker for at undersøge mekanismerne bag aktiv vasodilatation fra et termoregulerende synspunkt. I slutningen af 1990’erne blev denne metode brugt til at undersøge både neurale og endotelmekanismer med hensyn til lokal opvarmning af huden. Siden da er teknikken blevet brugt til at undersøge en række neurovaskulære signalmekanismer i huden.

Ved hjælp af denne teknik har vores gruppe og andre undersøgt mekanismerne for endoteldysfunktion i mikrovaskulaturen hos flere kliniske populationer, herunder, men ikke begrænset til, dyslipidæmi, primær aldring, diabetes, kronisk nyresygdom, polycystisk ovariesyndrom, præeklampsi, større depressiv lidelse 14,15,16,17,18,19 og hypertension ^20,21,22,23,24. For eksempel viste en tidligere undersøgelse, at normotensive kvinder med en historie med præeklampsi, som har en øget risiko for CVD, havde reduceret NO-medieret vasodilatation i kutancirkulationen sammenlignet med kvinder med en historie med normotensiv graviditet²⁰. I en anden undersøgelse viste voksne diagnosticeret med primær HTN øget angiotensin II-følsomhed i mikrovaskulaturen sammenlignet med raske kontroller²¹, og kronisk sulfhydryldonerende antihypertensiv farmakoterapi hos primære HTN-patienter har vist sig at sænke blodtrykket og forbedre både hydrogensulfid- og NO-medieret vasodilatation²². Wong et ^al.23 fandt nedsat sensorisk medieret og NO-medieret vasodilatation hos præhypertensive voksne, sammenfaldende med vores fund af en progression af endoteldysfunktion med stigende HTN-stadier, som kategoriseret af 2017 American Heart Association og American College of Cardiology retningslinjer²⁴.

Den intradermale mikrodialyseteknik muliggør tæt kontrollerede mekanistiske undersøgelser af mikrovaskulær funktion i sundheds- og sygdomstilstande. Derfor har dette papir til formål at beskrive den intradermale mikrodialyseteknik, som den anvendes af vores gruppe og andre. Vi beskriver procedurerne for både farmakologisk stimulering af endotelet med acetylcholin (ACh) for at undersøge dosis-responsforholdet og fysiologisk stimulering af endogen NO-produktion med enten en 39 °C eller 42 °C lokal opvarmningsstimulusprotokol. Vi præsenterer repræsentative resultater for hver tilgang og diskuterer de kliniske konsekvenser af de fund, der er opstået fra denne teknik.

Protocol

Alle procedurer er godkendt af Institutional Review Board ved Pennsylvania State University forud for deltagerrekruttering. 1. Opsætning af udstyr Tænd for den lokale varmeenhed og laser-Doppler-flowmåleren.BEMÆRK: Begge skal kalibreres inden dataindsamling i henhold til producentens anvisninger. Doppler-laserflowmåleren skal tilsluttes dataindsamlingshardware med prøveudtagning ved 100 Hz (100 prøver / min) og kontinuerlig optagelse i en dataindsamlingssoftware. Mens ande…

Representative Results

Acetylcholin dosis-respons protokol Figur 1A viser et skema, der beskriver ACh-dosis-respons-protokollen. Figur 1B illustrerer repræsentative sporinger af RBC-fluxværdierne (perfusionsenheder, PU; 30 s gennemsnit) fra den standardiserede ACh-dosis-responsprotokol for et emne over tid. Figur 1C illustrerer en rå datafil for en ACh-dosis-responsprotokol. Yderligere baseline-målinger ble…

Discussion

Den intradermale mikrodialyseteknik er et alsidigt værktøj inden for human vaskulær forskning. Efterforskere kan ændre protokollen for yderligere at diversificere dens applikationer. For eksempel beskriver vi en ACh dosis-respons protokol, men andre undersøgelser af mekanismerne for vasokonstriktion eller vasomotorisk tone, snarere end vasodilatation alene, har brugt noradrenalin eller natriumnitroprussid dosis-respons tilgange 26,27,28,29,30,31.<…

Materials

1 mL syringes	BD Syringes	302100
Acetlycholine	United States Pharmacopeia	1424511	Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator
Alcohol swabs	Mckesson	191089
Baby Bee Syringe Drive	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1001	In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized
CMA 30 Linear Microdialysis Probes	Harvard Apparatus	CMA8010460
Connex Spot Monitor	WelchAllyn	74CT-B	automated blood pressure monitor
Hive Syringe Pump Controller	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1020	Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives
LabChart 8	AD Instruments		**PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions
Lactated Ringer's Solution	Avantor (VWR)	76313-478
Laser Doppler Blood FlowMeter	Moor Instruments	MoorVMS-LDF
Laser Doppler probe calibration kit	Moor Instruments	CAL
Laser Doppler VP12 probe	Moor Instruments	VP12
Linear Microdialysis Probes	Bioanalytical Systems, Inc.	MD-2000
NG-nitro-l-arginine methyl ester	Sigma Aldrich	483125-M	L-NAME
Povidone-iodine / betadine	Dynarex	1202
PowerLab C Data Acquisition Device	AD Instruments	PLC01	**
PowerLab C Instrument Interface	AD Instruments	PLCI1	**
Probe adhesive discs	Moor Instruments		attach local heating unit to skin
Skin Heater Controller	Moor Instruments	moorVMS-HEAT 1.3
Small heating probe	Moor Instruments	VHP2
Sterile drapes	Halyard	89731
Sterile gauze	Dukal Corporation	2085
Sterile surgical gloves	Esteem Cardinal Health	8856N	catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium)
Surgical scissors	Cole-Parmer	UX-06287-26