מיקרודיאליזה תוך-עורית: גישה לחקר מנגנונים חדשים של תפקוד לקוי של כלי דם בבני אדם
Summary
מיקרודיאליזה תוך עורית היא טכניקה זעיר פולשנית המשמשת לחקר תפקוד כלי הדם בבריאות ובמחלות. ניתן להשתמש הן בפרוטוקולי תגובת מינון והן בפרוטוקולי חימום מקומיים עבור טכניקה זו כדי לחקור מנגנונים של הרחבת כלי דם והתכווצות כלי דם במחזור הדם העורי.
Abstract
כלי הדם העוריים הם רקמה נגישה שניתן להשתמש בה כדי להעריך תפקוד כלי דם בבני אדם. מיקרודיאליזה תוך-עורית היא טכניקה זעיר פולשנית המשמשת לחקר מנגנונים של שריר חלק בכלי הדם ותפקוד האנדותל במחזור הדם העורי. טכניקה זו מאפשרת דיסקציה פרמקולוגית של הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של אנדותל כלי הדם כפי שאינדקס על ידי ירידה בהרחבת כלי הדם בתיווך תחמוצת החנקן, אינדיקטור לסיכון להתפתחות מחלות לב וכלי דם. בטכניקה זו, בדיקת מיקרודיאליזה ממוקמת בשכבה העורית של העור, ויחידת חימום מקומית עם בדיקת זרימת דופלר לייזר ממוקמת מעל הבדיקה כדי למדוד את שטף תאי הדם האדומים. טמפרטורת העור המקומית מהודקת או מגורה באמצעות יישום חום ישיר, וחומרים פרמקולוגיים מחוררים דרך הגשושית כדי לעורר או לעכב מסלולי איתות תוך תאיים על מנת לגרום להרחבת כלי דם או להתכווצות כלי דם או לחקור מנגנונים מעניינים (קו-פקטורים, נוגדי חמצון וכו ‘). מוליכות כלי הדם העורית מכומתת, וניתן להגדיר מנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל במצבי מחלה.
Introduction
מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בארצות הברית1. יתר לחץ דם (HTN) הוא גורם סיכון עצמאי לשבץ, מחלות לב כליליות ואי ספיקת לב ומוערך כי הוא משפיע על למעלה מ ~ 50% מאוכלוסיית ארצות הברית2. HTN יכול להתפתח כ-CVD עצמאי (HTN ראשוני) או כתוצאה ממצב אחר, כגון מחלת כליות פוליציסטית ו/או הפרעות אנדוקריניות (HTN משני). רוחב האטיולוגיות של HTN מסבך את החקירות לגבי המנגנונים הבסיסיים והנזק לאיברי הקצה שנצפו עם HTN. יש צורך בגישות מחקר מגוונות וחדשניות לפתופיזיולוגיה של הנזק לאיברי הקצה הקשורים ל-HTN.
אחד הסימנים הפתולוגיים המוקדמים ביותר של CVD הוא תפקוד לקוי של האנדותל, המאופיין בהרחבת כלי דם בתיווך תחמוצת החנקן (NO) 3,4,5. התרחבות בתיווך זרימה היא גישה נפוצה המשמשת לכימות תפקוד לקוי של האנדותל הקשור ל- CVD, אך תפקוד לקוי של האנדותל במיטות מיקרו-וסקולריות יכול להיות גם בלתי תלוי וגם מקדים לזה של עורקי צינור גדולים 6,7,8. יתר על כן, עורקי התנגדות מופעלים באופן ישיר יותר על ידי רקמות מקומיות מאשר עורקי צינור ויש להם שליטה מיידית יותר על אספקת דם עשיר בחמצן. תפקוד כלי הדם מנבא הישרדות שלילית ללא אירועים קרדיווסקולריים 9,10,11. כלי הדם העוריים הם מצע כלי דם נגיש שניתן להשתמש בו כדי לבחון תגובות לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים או מרחיבי כלי דם. מיקרודיאליזה תוך עורית היא טכניקה זעיר פולשנית, שמטרתה לחקור את המנגנונים של שריר חלק כלי דם ותפקוד האנדותל במיקרו-וסקולטורה העורית עם דיסקציה פרמקולוגית ממוקדת. שיטה זו מנוגדת לטכניקות אחרות, כגון היפרמיה תגובתית פוסט-חסימתית, שאינה מאפשרת דיסקציה פרמקולוגית, ויונטופורזיס, המאפשרת מתן תרופתי אך פחות מדויקת במנגנון הפעולה שלה (נסקרה ביסודיות במקום אחר12).
הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו נסקר בהרחבה במקום אחר13. גישה זו פותחה במקור לשימוש במחקר נוירולוגי במכרסמים ולאחר מכן יושמה לראשונה על בני אדם כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס הרחבת כלי הדם הפעילה מנקודת מבט תרמו-רגולטורית. בסוף שנות ה-90 של המאה ה-20 נעשה שימוש בשיטה זו לבחינת מנגנונים עצביים ואנדותל בהקשר של חימום מקומי של העור. מאז, הטכניקה שימשה לחקר מספר מנגנוני איתות נוירו-וסקולריים בעור.
באמצעות טכניקה זו, הקבוצה שלנו ואחרים חקרו את המנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל בכלי הדם הזעירים של מספר אוכלוסיות קליניות, כולל, אך לא רק, דיסליפידמיה, הזדקנות ראשונית, סוכרת, מחלת כליות כרונית, תסמונת השחלות הפוליציסטיות, רעלת הריון, הפרעת דיכאון מג’ורי 14,15,16,17,18,19 ויתר לחץ דם 20,21,22,23,24. לדוגמה, מחקר קודם מצא כי נשים נורמוטנסיות עם היסטוריה של רעלת הריון, אשר נמצאות בסיכון מוגבר ל- CVD, הפחיתו את הרחבת כלי הדם ללא תיווך במחזור הדם העורי בהשוואה לנשים עם היסטוריה של הריון נורמוטנסי20. במחקר אחר, מבוגרים שאובחנו עם HTN ראשוני הדגימו רגישות מוגברת לאנגיוטנסין II במיקרו-וסקולטורה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה21, ופרמקותרפיה אנטי-יתר לחץ דם כרונית התורמת סולפידריל בחולי HTN ראשוניים הוכחה כמפחיתה לחץ דם ומשפרת הן מימן גופרתי והן הרחבת כלי דם מתווכת NO22. Wong et al.23 מצאו התרחבות כלי דם פגומה בתיווך חושי וללא תיווך אצל מבוגרים טרום יתר לחץ דם, במקביל לממצא שלנו של התקדמות של תפקוד לקוי של האנדותל עם עלייה בשלבי HTN, כפי שסווג על ידי איגוד הלב האמריקאי 2017 והנחיות המכללה האמריקאית לקרדיולוגיה24.
טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית מאפשרת חקירות מכניסטיות מבוקרות היטב של תפקוד כלי הדם במצבי בריאות ומחלות. לכן, מאמר זה נועד לתאר את טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית כפי שהיא מיושמת על ידי הקבוצה שלנו ואחרים. אנו מפרטים את ההליכים הן לגירוי פרמקולוגי של האנדותל עם אצטילכולין (ACh) כדי לבחון את יחסי המינון-תגובה והן את הגירוי הפיזיולוגי של ייצור NO אנדוגני עם פרוטוקול גירוי חימום מקומי של 39 ° C או 42 ° C. אנו מציגים תוצאות מייצגות עבור כל גישה ודנים בהשלכות הקליניות של הממצאים שעלו מטכניקה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת המיקרודיאליזה התוך-עורית היא כלי רב-תכליתי בחקר כלי הדם בבני אדם. החוקרים עשויים לשנות את הפרוטוקול כדי לגוון עוד יותר את היישומים שלו. לדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול תגובת מינון ACh, אך מחקרים אחרים על מנגנוני התכווצות כלי הדם או הטונוס הוואזו-מוטורי, ולא הרחבת כלי הדם בלבד, השתמשו בגיש?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
Riferimenti
- Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E. Mortality in the United States, 2021. NCHS Data Brief. 456, (2022).
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93 (2023).
- Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).
- Park, K. H., Park, W. J. Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches. Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).
- Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. Microcirculation in hypertension: a new target for treatment. Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).
- Sara, J. D., et al. Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).
- Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients. Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).
- Rossi, M., et al. Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment. Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).
- Pepine, C. J., et al. Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women’s Ischemia Syndrome Evaluation) study. Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).
- Matsuda, J., et al. Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention. Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400 (2016).
- Gupta, A., et al. Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).
- Roustit, M., Cracowski, J. L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).
- Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow. European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).
- Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations. Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).
- Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin. Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).
- Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).
- DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).
- Sprung, V. S., et al. Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training. Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).
- Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder. Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).
- Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).
- Greaney, J. L., et al. Impaired hydrogen sulfide-mediated vasodilation contributes to microvascular endothelial dysfunction in hypertensive adults. Hypertension. 69 (5), 902-909 (2017).
- Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension. Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).
- Wong, B. J., et al. Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).
- Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).
- Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures. Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine. Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).
- Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction. Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).
- Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).
- Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults. Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697 (2020).
- Nakata, T., et al. Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury. American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).
- Tucker, M. A., et al. Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status. European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).
- Craighead, D. H., Alexander, L. M. Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women. American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).
- Brunt, V. E., Minson, C. T. KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin. Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).
- Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia. Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).
- Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).
- Jung, F., et al. Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).
