Microdiálisis intradérmica: un enfoque para investigar nuevos mecanismos de disfunción microvascular en humanos
Summary
La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva que se utiliza para investigar la función microvascular en la salud y la enfermedad. Tanto los protocolos dosis-respuesta como los de calentamiento local se pueden utilizar para esta técnica para explorar los mecanismos de vasodilatación y vasoconstricción en la circulación cutánea.
Abstract
La vasculatura cutánea es un tejido accesible que se puede utilizar para evaluar la función microvascular en humanos. La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva que se utiliza para investigar los mecanismos del músculo liso vascular y la función endotelial en la circulación cutánea. Esta técnica permite la disección farmacológica de la fisiopatología de la disfunción endotelial microvascular indexada por la disminución de la vasodilatación mediada por óxido nítrico, un indicador del riesgo de desarrollo de enfermedades cardiovasculares. En esta técnica, se coloca una sonda de microdiálisis en la capa dérmica de la piel y se coloca una unidad de calentamiento local con una sonda de flujometría láser Doppler sobre la sonda para medir el flujo de glóbulos rojos. La temperatura local de la piel se restringe o estimula con la aplicación directa de calor, y los agentes farmacológicos se perfunden a través de la sonda para estimular o inhibir las vías de señalización intracelular con el fin de inducir vasodilatación o vasoconstricción o para interrogar mecanismos de interés (cofactores, antioxidantes, etc.). Se cuantifica la conductancia vascular cutánea y se pueden delinear los mecanismos de disfunción endotelial en estados patológicos.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte enlos Estados Unidos. La hipertensión arterial (HTA) es un factor de riesgo independiente para el accidente cerebrovascular, la enfermedad coronaria y la insuficiencia cardíaca y se estima que afecta a más del ~ 50% de la población de los Estados Unidos2. La HTA puede desarrollarse como una ECV independiente (HTA primaria) o como resultado de otra afección, como la enfermedad renal poliquística y/o los trastornos endocrinos (HTA secundaria). La amplitud de las etiologías de la HTA complica las investigaciones sobre los mecanismos subyacentes y el daño a los órganos terminales observado con la HTA. Se necesitan enfoques de investigación diversos y novedosos sobre la fisiopatología del daño a los órganos terminales asociado con la HTA.
Uno de los primeros signos patológicos de ECV es la disfunción endotelial, caracterizada por una vasodilatación mediada por óxido nítrico (NO)alterada 3,4,5. La dilatación mediada por flujo es un enfoque común utilizado para cuantificar la disfunción endotelial asociada con la ECV, pero la disfunción endotelial en los lechos microvasculares puede ser independiente y precursora de la de las grandes arterias de los conductos 6,7,8. Además, las arteriolas de resistencia actúan más directamente sobre el tejido local que las arterias conducto y tienen un control más inmediato sobre el suministro de sangre rica en oxígeno. La función microvascular es predictiva de supervivencia libre de eventos cardiovasculares adversos 9,10,11. La microvasculatura cutánea es un lecho vascular accesible que se puede utilizar para examinar las respuestas a estímulos vasoconstrictores o vasodilatadores fisiológicos y farmacológicos. La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva, cuyo objetivo es investigar los mecanismos de la función vascular del músculo liso y endotelial en la microvasculatura cutánea con disección farmacológica dirigida. Este método contrasta con otras técnicas, como la hiperemia reactiva post-oclusiva, que no permite la disección farmacológica, y la iontoforesis, que permite la administración farmacológica pero es menos precisa en su mecanismo de acción (revisado en profundidad en otro lugar12).
La justificación del desarrollo y uso de esta técnica se examina ampliamente en otro lugar13. Este enfoque se desarrolló originalmente para su uso en la investigación neurológica en roedores y luego se aplicó por primera vez a los humanos para investigar los mecanismos subyacentes a la vasodilatación activa desde un punto de vista termorregulador. A finales de la década de 1990, este método se utilizó para examinar los mecanismos neurales y endoteliales con respecto al calentamiento local de la piel. Desde entonces, la técnica se ha utilizado para investigar una serie de mecanismos de señalización neurovascular en la piel.
Utilizando esta técnica, nuestro grupo y otros han interrogado los mecanismos de la disfunción endotelial en la microvasculatura de varias poblaciones clínicas, incluyendo, entre otras, dislipidemia, envejecimiento primario, diabetes, enfermedad renal crónica, síndrome de ovario poliquístico, preeclampsia, trastorno depresivo mayor 14,15,16,17,18,19 e hipertensión 20,21,22,23,24. Por ejemplo, un estudio previo encontró que las mujeres normotensas con antecedentes de preeclampsia, que tienen un mayor riesgo de ECV, tenían una vasodilatación mediada por NO reducida en la circulación cutánea en comparación con las mujeres con antecedentes de embarazo normotenso20. En otro estudio, los adultos diagnosticados con HTA primaria demostraron una mayor sensibilidad a la angiotensina II en la microvasculatura en comparación con los controles sanos21, y se ha demostrado que la farmacoterapia antihipertensiva con donación crónica de sulfhidrilo en pacientes con HTA primaria disminuye la presión arterial y mejora tanto la vasodilatación mediada por sulfuro de hidrógeno como por NO22. Wong et al.23 encontraron una vasodilatación sensitiva y mediada por NO en adultos prehipertensos, coincidiendo con nuestro hallazgo de una progresión de la disfunción endotelial con el aumento de los estadios de HTA, según la categorización de las guías de la Asociación Americana del Corazón y el Colegio Americano de Cardiología de 201724.
La técnica de microdiálisis intradérmica permite realizar investigaciones mecanicistas estrictamente controladas sobre la función microvascular en estados de salud y enfermedad. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo describir la técnica de microdiálisis intradérmica aplicada por nuestro grupo y otros. Detallamos los procedimientos tanto para la estimulación farmacológica del endotelio con acetilcolina (ACh) para examinar la relación dosis-respuesta como para la estimulación fisiológica de la producción endógena de NO con un protocolo de estímulo de calentamiento local a 39 °C o 42 °C. Presentamos resultados representativos para cada abordaje y discutimos las implicaciones clínicas de los hallazgos que han surgido de esta técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de microdiálisis intradérmica es una herramienta versátil en la investigación vascular humana. Los investigadores pueden modificar el protocolo para diversificar aún más sus aplicaciones. Por ejemplo, describimos un protocolo dosis-respuesta de ACh, pero otras investigaciones sobre los mecanismos de vasoconstricción o tono vasomotor, en lugar de la vasodilatación sola, han utilizado enfoques dosis-respuesta de norepinefrina o nitroprusiato sódico 26,27,28,29,30,31.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 1 mL syringes | BD Syringes | 302100 | |
| Acetlycholine | United States Pharmacopeia | 1424511 | Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator |
| Alcohol swabs | Mckesson | 191089 | |
| Baby Bee Syringe Drive | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1001 | In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized |
| CMA 30 Linear Microdialysis Probes | Harvard Apparatus | CMA8010460 | |
| Connex Spot Monitor | WelchAllyn | 74CT-B | automated blood pressure monitor |
| Hive Syringe Pump Controller | Bioanalytical Systems, Incorporated | MD-1020 | Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives |
| LabChart 8 | AD Instruments | **PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions | |
| Lactated Ringer's Solution | Avantor (VWR) | 76313-478 | |
| Laser Doppler Blood FlowMeter | Moor Instruments | MoorVMS-LDF | |
| Laser Doppler probe calibration kit | Moor Instruments | CAL | |
| Laser Doppler VP12 probe | Moor Instruments | VP12 | |
| Linear Microdialysis Probes | Bioanalytical Systems, Inc. | MD-2000 | |
| NG-nitro-l-arginine methyl ester | Sigma Aldrich | 483125-M | L-NAME |
| Povidone-iodine / betadine | Dynarex | 1202 | |
| PowerLab C Data Acquisition Device | AD Instruments | PLC01 | ** |
| PowerLab C Instrument Interface | AD Instruments | PLCI1 | ** |
| Probe adhesive discs | Moor Instruments | attach local heating unit to skin | |
| Skin Heater Controller | Moor Instruments | moorVMS-HEAT 1.3 | |
| Small heating probe | Moor Instruments | VHP2 | |
| Sterile drapes | Halyard | 89731 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporation | 2085 | |
| Sterile surgical gloves | Esteem Cardinal Health | 8856N | catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium) |
| Surgical scissors | Cole-Parmer | UX-06287-26 |
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