Hepatisk glukoseproduktion, ureagenese og lipolyse kvantificeret ved hjælp af den perfunderede muselevermodel

Summary

Her præsenterer vi en robust metode til in situ perfusion af museleveren for at studere den akutte og direkte regulering af levermetabolisme uden at forstyrre leverarkitekturen, men i fravær af ekstra-hepatiske faktorer.

Abstract

Leveren har mange funktioner, herunder næringsstofmetabolisme. I modsætning til andre in vitro – og in vivo-modeller af leverforskning tillader den isolerede perfunderede lever undersøgelse af leverbiologi og metabolisme i hele leveren med en intakt leverarkitektur, adskilt fra påvirkning af ekstra-hepatiske faktorer. Leverperfusioner blev oprindeligt udviklet til rotter, men metoden er også tilpasset mus. Her beskriver vi en protokol for in situ perfusion af museleveren. Leveren perfuseres antegradely gennem portalvenen med oxygeneret Krebs-Henseleit bicarbonatbuffer, og udgangen opsamles fra den suprahepatiske ringere vena cava med fastspænding af den infrahepatiske ringere vena cava for at lukke kredsløbet. Ved hjælp af denne metode kan de direkte hepatiske virkninger af en testforbindelse evalueres med en detaljeret tidsopløsning. Leverfunktion og levedygtighed er stabile i mindst 3 timer, hvilket gør det muligt at inkludere interne kontroller i samme eksperiment. De eksperimentelle muligheder ved hjælp af denne model er talrige og kan udlede indsigt i leverfysiologi og leversygdomme.

Introduction

Leveren er et vigtigt organ i stofskiftet. Det spiller en central rolle i styringen af hele kroppens energibalance ved at regulere glukose, lipid og aminosyremetabolisme. Stigningen i leversygdomme på verdensplan fremstår som en stor global sundhedsbyrde, og der er behov for mere viden om patofysiologien og dens konsekvenser for leverfunktioner.

Forskellige in vitro-modeller er blevet udviklet til forskning i leveren som supplement til in vivo-undersøgelser. Isolerede og dyrkede primære hepatocytter fra gnavere og mennesker anvendes i vid udstrækning. Ikke-parenkymale celler kan adskilles fra hepatocytter ved anvendelse af differentiel og gradientcentrifugering, og cokulturen af forskellige celletyper er nyttig til undersøgelse af intercellulær krydstale¹. Selvom primære humane hepatocytter betragtes som den gyldne standard for test af lægemiddeltoksicitet, har flere undersøgelser vist, at hepatocytterne hurtigt dedifferentieres i vævskultur, hvilket resulterer i tab af leverfunktioner ^2,3,4. Hepatocytkultur i et 3D-sfærisk system forbedrer dedifferentieringen, er mere stabil og ser ud til at efterligne leveren in vivo i højere grad end de traditionelle 2D-kultursystemer⁵. Præcisionskårne leverskiver er en anden veletableret in vitro-model, der holder vævsarkitekturen intakt og indeholder de ikke-parenkymale celler, der er til stede i leveren⁶. Mere avancerede in vitro modeller omfatter lever-on-a-chip⁷ og leverorganoider⁸. Men med alle disse tilgange er der et tab af strukturel integritet og strømningsdynamik, herunder vektorial portal-hepatisk venestrøm, hvilket sandsynligvis påvirker generaliserbarheden.

Den isolerede perfunderede rottelever blev først beskrevet af Claude Bernard i 1855⁹ og bruges stadig inden for forskellige videnskabelige områder til studier af leverbiologi, toksikologi og patofysiologi. Fordele ved den perfunderede lever sammenlignet med de ovennævnte in vitro-modeller inkluderer vedligeholdelse af leverarkitekturen, vaskulær strømning, hepatocytpolaritet og zoneinddeling og interaktionerne mellem hepatocytter og ikke-parenkymale celler. Sammenlignet med in vivo-undersøgelser tillader den perfunderede lever undersøgelse af levermetabolisme på en isoleret måde for at undgå ekstrahepatiske faktorer, der bæres af blodet og med fuldstændig kontrol over de eksperimentelle betingelser. Flere ændringer er blevet foretaget for at forbedre rotteleverperfusionsmodellen gennem årene^10,11,12,13. Selvom mus er blevet brugt til isolerede perfunderede leverundersøgelser, er der mindre litteratur tilgængelig. Her præsenterer vi en metode til in situ perfusion af museleveren ved kanylering af portalvenen og den suprahepatiske vena cava ringere til at studere de akutte og direkte metaboliske reaktioner på metaboliske substrater og hormoner målt i det hepatiske venøse udløb fra museleveren i realtid.

Protocol

Alle dyreforsøg er udført med tilladelse fra Dyreforsøgstilsynet, Miljø- og Fødevareministeriet (tilladelse 2018-15-0201-01397) og den lokale etiske komité i overensstemmelse med EU-direktivet 2010/63/EU, National Institutes of Health (publikation nr. 85-3) og efter retningslinjerne i dansk lovgivning om dyreforsøg (1987). Dette er en terminal procedure, og dødsårsagen er ekssanguination og perforering af membranen under dyb anæstesi. 1. Forsøgsdyr Få mus…

Representative Results

En stabil baseline er nødvendig for at bestemme, om en stimulus eller substrat fører til frigivelse af molekylet af interesse. Figur 3A viser et eksempel på et vellykket eksperiment. Produktionen af urinstof i den perfunderede lever måles i intervaller på 2 minutter og vises som gennemsnit ± SEM. Baselineperioderne forud for hver af de to stimuleringsperioder er stabile. Den gennemsnitlige urinstofproduktion i de to stimuleringsperioder og de respektive…

Discussion

Den isolerede perfunderede muselever er et stærkt forskningsværktøj til studier af dynamikken og molekylære mekanismer i levermetabolismen. Muligheden for minut-til-minut prøveindsamling giver en detaljeret evaluering af den direkte virkning af en testforbindelse på leveren. Sammenlignet med di vivo-undersøgelser giver den perfunderede lever os mulighed for at studere levermetabolisme på en isoleret måde og undgå ekstra-hepatiske faktorer, der bæres af blodet og med fuldstændig kontrol over de eksper…