अध्ययन डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक सरल, त्वरित और आंशिक रूप से स्वचालित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
एकल-कोशिका और एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण ट्रांसक्रिप्टोमिक जानकारी के धन के कारण आम प्रयोगशाला अनुप्रयोग बन गए हैं जो वे प्रदान करते हैं। एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण, विशेष रूप से, मुश्किल-से-अलग ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण जमे हुए (अभिलेखीय) सामग्री के साथ भी संगत है। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों और अभिकर्मकों का उपयोग करके आंशिक रूप से स्वचालित तरीके से डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, एक रोबोट डिस्सोसिएटर का उपयोग ऊतक समरूपीकरण को स्वचालित और मानकीकृत करने के लिए किया जाता है, इसके बाद नाभिक को फ़िल्टर करने के लिए एक अनुकूलित रासायनिक ढाल होता है। अंत में, हम एक स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक को सटीक और स्वचालित रूप से गिनते हैं। इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन माउस मस्तिष्क, चूहे के गुर्दे और साइनोमोलगस यकृत और प्लीहा ऊतक पर प्रदर्शित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता के बिना विभिन्न स्तनधारी ऊतकों के लिए सरल, तेज़ और आसानी से अनुकूलनीय है और डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक प्रदान करता है।
थोक आरएनए अनुक्रमण की तुलना में जीन अभिव्यक्ति के बढ़ते संकल्प के कारण एकल-कोशिका (एससी) और एकल-नाभिक (एसएन) आरएनए अनुक्रमण आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल बन गए हैं। हालांकि, ठोस ऊतकों से अच्छी गुणवत्ता वाले एकल कोशिका और एकल नाभिक की तैयारी का अलगाव एक चुनौती बनी हुई है और अक्सर एससी / एसएन-आरएनएसेक प्रयोगों में दर-सीमित कदम है। वास्तव में, प्रोटोकॉल की एक बहुतायत विकसित की गई है जो सेल / नाभिक निलंबन 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 प्राप्त करने के लिए विभिन्न रासायनिक और यांत्रिक प्रक्रियाओं का उपयोग करती है।. इसके अलावा, मलबे / झुरमुट आदि से ऐसी तैयारी को साफ करने की रणनीतियां, प्रवाह छंटाई से निस्पंदन से धोने तक होती हैं। इस तरह के प्रोटोकॉल अक्सर मैनुअल होते हैं (उपयोगकर्ता से संबंधित परिवर्तनशीलता के लिए अग्रणी), समय लेने वाले हो सकते हैं (जिससे सेल / न्यूक्लियस व्यवहार्यता कम हो जाती है), और / या सेल / न्यूक्लियस सॉर्टिंग के लिए फ्लो साइटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता हो सकती है। इस अध्ययन ने डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से एक सरल, त्वरित और आंशिक रूप से स्वचालित एकल नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया। हमने विशेष रूप से सेल अलगाव के विपरीत नाभिक अलगाव पर ध्यान केंद्रित किया क्योंकि यह जमे हुए ऊतकों के उपयोग के साथ संगत है, नमूना संग्रह / प्रसंस्करण को अधिक व्यावहारिक बनाता है और नमूनों के निष्पक्ष बैचिंग को सक्षम करता है, खासकर समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों में। इसके अलावा, हालांकि परमाणु प्रतिलेख पूरी तरह से सेलुलर ट्रांसक्रिपटम को प्रतिबिंबित नहीं करता है, कई अध्ययनों से अब पता चला है कि एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण डेटा सेल-प्रकार की पहचान के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा के बराबर है, भले ही सेल प्रकारों का अनुपात 6,16,17,18,19 भिन्न हो सकता है।
नाभिक अलगाव में कई चरण होते हैं: 1) नाभिक को छोड़ने के लिए ऊतक का यांत्रिक या रासायनिक विघटन, 2) मलबे और झुरमुट की सफाई, और 3) डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की तैयारी के लिए नाभिक की सटीक गिनती। कई प्रोटोकॉल में, चरण 1 में अक्सर ऊतक 3,20 को बाधित करने के लिए डोंस होमोजिनाइज़र का उपयोग शामिल होता है। वैकल्पिक रूप से, रासायनिक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि इन्हें अक्सर विभिन्न ऊतकों 2,5,6 के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। हमने अनुभव किया है कि एक मैनुअल ऊतक विघटन प्रक्रिया ऑपरेटर से जुड़ी परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है, जिससे नाभिक की परिवर्तनीय गुणवत्ता और उपज होती है। तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने और ऊतकों में काम करने वाले अधिक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल रखने के लिए, एक प्रोटोकॉल जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोबोट ऊतक विघटनकारी का उपयोग करता है,विकसित किया गया था। चरण 2 के लिए, हालांकि बफर एक्सचेंज आमतौर पर नाभिक को धोने के लिए सबसे सरल साधन है, हमने मलबे को अधिक पूरी तरह से हटाने के लिए अपेक्षाकृत कम सुक्रोज ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन चरण का उपयोग अपनाया। विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, हम अधिक प्रभावी माइलिन हटाने के लिए सुक्रोज ढाल के बजाय सिलिका कोलाइड ढाल का उपयोग करते हैं। अंत में, गिनती के लिए, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग नाभिक की गिनती और नेत्रहीन निरीक्षण के लिए स्वर्ण मानक है। हमारे प्रोटोकॉल में, इस कदम को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर22 का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से स्वचालित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया है और यह विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों (चूहा, माउस और गैर-मानव प्राइमेट) से मस्तिष्क, गुर्दे, प्लीहा और यकृत सहित कई जमे हुए स्तनधारी ऊतकों के साथ संगत है और एक बूंद-आधारित वाणिज्यिक मंच के साथ डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक प्रदान करता है। प्रोटोकॉल ऊतक तैयार करने से एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण वर्कफ़्लो की शुरुआत तक लगभग 75 मिनट लेता है।
हमने जमे हुए स्तनधारी ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक प्राप्त करने के लिए एक बहुमुखी और आंशिक रूप से स्वचालित प्रोटोकॉल विकसित किया है और माउस मस्तिष्क, चूहे के गुर्दे और साइनोमोलगस यकृत और प्लीहा ऊतक पर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है।
मस्तिष्क, गुर्दे, प्लीहा और यकृत ऊतक 6,7,20,24,25,26 में एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन की तुलना करते समय, हम देखते हैं कि हम प्रति नाभिक समान संख्या में जीन और यूएमआई गणना का पता लगाने में सक्षम हैं और अपेक्षित सेल प्रकारों को पुनर्प्राप्त करने में सक्षम हैं। मौजूदा तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं। सबसे पहले, इस अध्ययन में प्रोटोकॉल ऊतक समरूपीकरण और एकल नाभिक के अलगाव को स्वचालित करता है। यह एक रोबोट ऊतक अवरोधक21 के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाता है। अधिकांश प्रोटोकॉल में, एकल नाभिक 3,20 को मुक्त करने के लिए ऊतक को डोंस होमोजिनाइज़र के साथ समरूप किया जाता है। हालांकि, हमने देखा है कि यह मैनुअल कदम समरूपीकरण के दौरान लगाए गए बल की मात्रा के आधार पर नाभिक उपज और अखंडता में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है, प्रयोगों की प्रजनन क्षमता से समझौता कर सकता है। यहां, निश्चित सेटिंग्स के साथ एक स्वचालित ऊतक ग्राइंडर का उपयोग करके, प्रयोगों में अधिक स्थिरता के साथ अच्छी नाभिक गुणवत्ता और उपज प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, इस चरण को स्वचालित करने से प्रोटोकॉल का हैंड-ऑन समय भी कम हो जाता है (ऊतक विघटन चरण में लगभग 7 मिनट लगते हैं), जिससे उपयोगकर्ता को बाद के चरणों के लिए तैयार करने की अनुमति मिलती है। दूसरा, इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल बहुमुखी है, यानी, यह विभिन्न प्रजातियों के विभिन्न ऊतकों के साथ संगत है। यह हमें लंबे प्रोटोकॉल अनुकूलन से बचने में सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, विभिन्न ऊतकों 2,5,6 के लिए होमोजेनाइजेशन बफर / डिटर्जेंट की पहचानकरने के लिए। तीसरा, यह प्रोटोकॉल स्वच्छ नाभिक प्राप्त करने के लिए फ्लो सॉर्टर तक पहुंच पर निर्भर नहीं करता है, इसलिए इसे उन प्रयोगशालाओं के लिए अधिक सुलभ बनाता है जिनके पास प्रवाह छंटाई के लिए आवश्यक उपकरण / विशेषज्ञता नहीं है। इसके बजाय, हमने अधिकांश मलबे को हटाने के लिए सुक्रोज ढाल-आधारित निस्पंदन को अनुकूलित किया। हालांकि, विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, अधिक कुशल माइलिन हटाने के लिए सुक्रोज ढाल के बजाय सिलिका कोलाइड ढाल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हमने यह भी पाया है कि सुक्रोज/सिलिका कोलाइड ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के अंत में स्विंगिंग-बकेट रोटर का उपयोग नाभिक के नुकसान को कम करता है। इसलिए, इस तरह के रोटर का उपयोग अत्यधिक अनुशंसित है। चौथा, नाभिक की गणना करने के लिए कई तरीकों का परीक्षण करने के बाद (माइक्रोस्कोप के तहत मैनुअल गिनती, कई स्वचालित काउंटरों का उपयोग), एक स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर22 के उपयोग की सिफारिश की जाती है। प्रोपिडियम आयोडाइड जैसे डीएनए इंटरकैलेटिंग डाई का उपयोग, नाभिक गिनती की सटीकता को बढ़ाता है। पांचवां, इस प्रोटोकॉल को माइक्रोफ्लुइडिक चिप लोड करने से शुरू करने में लगभग 75 मिनट लगते हैं। यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि कई नमूनों को संसाधित करते समय नाभिक अखंडता उच्च रहती है। अंत में, हमने प्रोटोकॉल को इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) -एम्बेडेड ऊतक के साथ भी संगत पाया है। यदि ऐसी सामग्री का उपयोग किया जाता है, तो होमोजेनाइजेशन से पहले स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को ओसीटी ब्लॉक से हटाया जा सकता है।
एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण डेटासेट में एक लगातार चुनौती परिवेश आरएनए की उपस्थिति है, जो गैर-परमाणु (जैसे, माइटोकॉन्ड्रियल) के साथ-साथ परमाणु व्युत्पन्न27,28 हो सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में, माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए (गैर-परमाणु परिवेश आरएनए के लिए एक प्रॉक्सी) फ़िल्टरिंग से पहले भी कम है (दिखाए गए ऊतकों के लिए 0.1-1.6%)। हालांकि, अन्य प्रोटोकॉल और डेटासेट के समान, प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों (जैसे यकृत में हेपेटोसाइट्स, दिमाग में न्यूरॉन्स, आदि) के नाभिक में अत्यधिक व्यक्त जीन से परिवेशी आरएनए संदूषण अभीभी मौजूद है। कई जैव सूचना विज्ञान उपकरण, जैसे सेलबेंडर, सूपएक्स, आदि मौजूद हैं जो नाभिक एनोटेशन 29,30,31 से पहले ऐसे परिवेश आरएनए संदूषण को हटा सकते हैं। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यद्यपि ऊतक व्यवधान और नाभिक अलगाव चरण स्वचालित हैं, इस चरण का थ्रूपुट अभी भी सीमित है क्योंकि एक समय में केवल एक नमूना संसाधित किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि इस चरण में ऊतक के प्रति टुकड़े में केवल लगभग 7 मिनट लगते हैं, इसलिए कई नमूने अभी भी एक बैच में संसाधित किए जा सकते हैं। हम आम तौर पर प्रति बैच चार नमूने संसाधित करते हैं लेकिन अच्छे परिणामों के साथ प्रति बैच छह नमूने तक किए हैं। एक साथ दो नमूनों के समानांतर प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए रोबोटिक डिससोसिएटर में हालिया सुधार प्रति बैच 8-12 नमूनों के प्रसंस्करण को सक्षम करेगा, जो एकल नाभिक एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चिप के थ्रूपुट के साथ संगत है।
यद्यपि हमने इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए नाभिक का उपयोग अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे कि एटीएसी-सेक या एसएनआरएनएसेक के लिए अन्य प्लेटफार्मों का उपयोग करके नहीं किया है, यहां उपयोग किए जाने वाले जीन अभिव्यक्ति अभिकर्मकों के साथ प्राप्त डेटा की गुणवत्ता के आधार पर, हमारा मानना है कि हमारा प्रोटोकॉल अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संगत होना चाहिए। हालांकि, भविष्य के काम में इस प्रोटोकॉल को अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ परीक्षण करना शामिल होगा, जैसे कि एटीएसी-सेक।
निष्कर्ष में, हमने डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए एक त्वरित, सरल और आंशिक रूप से स्वचालित नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसे विभिन्न प्रकार के जमे हुए स्तनधारी ऊतकों के साथ संगत दिखाया गया है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस पांडुलिपि में विश्लेषण किए गए जानवरों के ऊतकों को प्रदान करने के लिए फिलिप बोचनर, मैरियन रिचर्डसन, पेट्रा स्टेबल और मैथियास सेलहॉसेन को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पेट्रा श्वाली, क्लास हटजे, रोलैंड श्मकी और मार्टिन एबेलिंग को उनके जैव सूचना विज्ञान समर्थन के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |