Studien beskriver en enkel, rask og delvis automatisert protokoll for å isolere kjerner av høy kvalitet fra frosne pattedyrvev for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering.
Enkeltcelle- og enkeltkjerne-RNA-sekvensering har blitt vanlige laboratorieapplikasjoner på grunn av det vell av transkriptomisk informasjon de gir. Enkelt kjerne RNA-sekvensering, spesielt, er nyttig for å undersøke genuttrykk i vanskelig å dissosiere vev. Videre er denne tilnærmingen også kompatibel med frosset (arkiv) materiale. Her beskriver vi en protokoll for å isolere enkeltkjerner av høy kvalitet fra frosne pattedyrvev for nedstrøms enkelt kjerne-RNA-sekvensering på en delvis automatisert måte ved bruk av kommersielt tilgjengelige instrumenter og reagenser. Spesielt brukes en robotdissosiator til å automatisere og standardisere vevshomogenisering, etterfulgt av en optimalisert kjemisk gradient for å filtrere kjernene. Til slutt teller vi nøyaktig og automatisk kjernene ved hjelp av en automatisert fluorescerende celleteller. Ytelsen til denne protokollen er demonstrert på musehjerne, rottenyre og cynomolguslever og miltvev. Denne protokollen er enkel, rask og lett tilpasningsdyktig til forskjellige pattedyrvev uten å kreve omfattende optimalisering og gir kjerner av god kvalitet for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering.
Enkeltcelle (sc) og enkeltkjerne (sn) RNA-sekvensering har blitt vanlige protokoller i molekylær og cellulær biologi på grunn av økt oppløsning av genuttrykk sammenlignet med bulk RNA-sekvensering. Imidlertid er isolering av enkeltcelle- og enkeltkjernepreparater av god kvalitet fra faste vev fortsatt en utfordring og er ofte det hastighetsbegrensende trinnet i sc / sn-RNAseq-eksperimenter. Faktisk har en mengde protokoller blitt utviklet som bruker forskjellige kjemiske og mekaniske prosedyrer for å oppnå celle / kjerner suspensjoner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Videre spenner strategier for å rydde opp slike preparater fra rusk / klumper, etc., fra strømningssortering til filtrering til vasking. Slike protokoller er ofte manuelle (fører til brukerrelatert variabilitet), kan være tidkrevende (fører til redusert celle / kjerne levedyktighet), og / eller kan kreve tilgang til et flowcytometer for celle / kjernesortering. Denne studien fokuserte på å utvikle en enkel, rask og delvis automatisert isolasjonsprotokoll for enkeltkjerner fra frosne pattedyrvev for nedstrøms RNA-sekvenseringsapplikasjoner. Vi fokuserte spesielt på kjerneisolering i motsetning til celleisolasjon, da det er kompatibelt med bruk av frosne vev, noe som gjør prøveinnsamling / prosessering mer praktisk og muliggjør objektiv batching av prøver, spesielt i tidskurseksperimenter. Videre, selv om nukleærtranskriptomet ikke fullt ut reflekterer det cellulære transkriptomet, har flere studier nå vist at enkeltkjerner RNA-sekvenseringsdata er sammenlignbare med enkeltcelle RNA-sekvenseringsdata for celletypeidentifikasjon, selv om proporsjonene av celletyper kan variere 6,16,17,18,19.
Kjerneisolering består av flere trinn: 1) mekanisk eller kjemisk forstyrrelse av vevet for å frigjøre kjernene, 2) opprydding av rusk og klumper, og 3) nøyaktig telling av kjerner for forberedelse for nedstrøms applikasjoner. I en rekke protokoller innebærer trinn 1 ofte bruk av en Dounce-homogenisator for å forstyrre vevet 3,20. Alternativt kan kjemiske metoder brukes, selv om disse ofte må optimaliseres for forskjellige vev 2,5,6. Vi har erfart at en manuell vevsforstyrrelsesprosedyre er utsatt for operatørassosiert variabilitet, noe som fører til variabel kvalitet og utbytte av kjerner. For å minimere teknisk variabilitet og å ha en mer konsistent og reproduserbar protokoll som fungerer på tvers av vev, ble det utviklet en protokoll som bruker en kommersielt tilgjengelig robotvevsdissosiator21. For trinn 2, selv om bufferutveksling vanligvis er den enkleste måten å vaske kjerner på, vedtok vi bruken av et relativt kort sukrosegradientsentrifugeringstrinn for å få en grundigere fjerning av rusk. For hjernevev spesifikt bruker vi en silikakolloidgradient i stedet for en sukrosegradient for mer effektiv myelinfjerning. Til slutt, for telling, er bruken av et hemocytometer gullstandarden for telling og visuell inspeksjon av kjernene. I vår protokoll kan dette trinnet automatiseres pålitelig ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig automatisert fluorescerende celleteller22. Denne protokollen er testet og er kompatibel med flere frosne pattedyrvev, inkludert hjerne, nyre, milt og lever, fra forskjellige pattedyrarter (rotte, mus og ikke-menneskelig primat) og gir kjerner av god kvalitet for nedstrøms enkeltkjerner RNA-sekvensering med en dråpebasert kommersiell plattform. Protokollen tar omtrent 75 minutter fra vevsforberedelse til starten av RNA-sekvenseringsarbeidsflyten med enkeltkjerner.
Vi har utviklet en allsidig og delvis automatisert protokoll for å oppnå enkeltkjerner av høy kvalitet fra frosne pattedyrvev og demonstrert protokollen på musehjerne, rottenyre og cynomolglever og miltvev.
Når vi sammenligner ytelsen til denne protokollen med andre publiserte protokoller for RNA-sekvensering med enkeltkjerne i hjerne-, nyre-, milt- og levervev 6,7,20,24,25,26, observerer vi at vi er i stand til å oppdage et tilsvarende antall gener og UMI-teller per kjerne og er i stand til å gjenopprette de forventede celletypene. Sammenlignet med eksisterende metoder er det flere fordeler med denne protokollen. For det første automatiserer protokollen i denne studien vevshomogenisering og isolering av enkeltkjerner. Dette oppnås ved bruk av en robotvevsforstyrrer21. I de fleste protokoller homogeniseres vev med en Dounce-homogenisator for å frigjøre enkeltkjerner 3,20. Vi har imidlertid lagt merke til at dette manuelle trinnet kan føre til eksperimentell variabilitet i kjerneutbytte og integritet avhengig av mengden kraft som utøves under homogenisering, noe som kompromitterer reproduserbarheten av forsøkene. Her, ved å bruke en automatisert vevskvern med faste innstillinger, ble det oppnådd god kjernekvalitet og utbytte med større konsistens på tvers av eksperimenter. Videre reduserer automatisering av dette trinnet også protokollens praktiske tid (vevsforstyrrelsestrinnet tar omtrent 7 minutter), slik at brukeren kan forberede seg på de påfølgende trinnene. For det andre er protokollen beskrevet i denne studien allsidig, det vil si at den er kompatibel med forskjellige vev fra forskjellige arter. Dette gjør at vi kan unngå langvarig protokolloptimalisering, for eksempel for å identifisere homogeniseringsbuffere / vaskemidler for forskjellige vev 2,5,6. For det tredje er denne protokollen ikke avhengig av tilgang til en strømningssorterer for å oppnå rene kjerner, og gjør den dermed mer tilgjengelig for laboratorier som ikke har nødvendig utstyr/kompetanse for strømningssortering. I stedet optimaliserte vi den sukrosegradientbaserte filtreringen for å fjerne det meste av rusk. For hjernevev anbefales det imidlertid å bruke en silikakolloidgradient i stedet for en sukrosegradient for mer effektiv myelinfjerning. Vi har også funnet at bruken av en svingende bøtte rotor på slutten av sukrose / silica kolloid gradient sentrifugering trinn minimerer kjerner tap. Derfor anbefales bruk av en slik rotor på det sterkeste. For det fjerde, etter å ha testet flere metoder for å telle kjerner (manuell telling under mikroskopet, bruk av flere automatiserte tellere), anbefales bruk av en automatisert fluorescerende celleteller22. Bruken av et DNA-interkalerende fargestoff, slik som propidiumjodid, øker nøyaktigheten av kjernetelling. For det femte tar denne protokollen omtrent 75 minutter fra start til lasting av mikrofluidbrikken. Dette bidrar til å sikre at kjerneintegriteten forblir høy ved behandling av flere prøver. Til slutt har vi funnet at protokollen også er kompatibel med optimalt skjæretemperaturforbindelse (OCT)-innebygd vev. Ved bruk av slikt materiale kan vevet fjernes fra OCT-blokken ved hjelp av en skalpell før homogenisering.
En hyppig utfordring i enkeltkjerner RNA-sekvenseringsdatasett er tilstedeværelsen av omgivende RNA, som kan være ikke-nukleær (f.eks. mitokondriell) så vel som kjernefysisk avledet27,28. I vår protokoll er mitokondrielt RNA (en proxy for ikke-nukleært omgivende RNA) lav selv før filtrering (0,1-1,6% for vevene vist). Imidlertid, i likhet med andre protokoller og datasett, er omgivende RNA-forurensning fra høyt uttrykte gener i kjernene av rikelig celletyper (som hepatocytter i leveren, nevroner i hjerner, etc.) fortsatt tilstede27. Det finnes flere bioinformatikkverktøy, som CellBender, SoupX, etc., som kan fjerne slik omgivende RNA-forurensning før kjerneannotasjon 29,30,31. En annen begrensning av denne protokollen er at selv om vevsforstyrrelsen og kjerneisolasjonstrinnene er automatiserte, er gjennomstrømningen av dette trinnet fortsatt begrensende ettersom bare én prøve kan behandles om gangen. Men siden dette trinnet bare tar omtrent 7 minutter per stykke vev, kan flere prøver fortsatt behandles i en batch. Vi behandler vanligvis fire prøver per batch, men har gjort opptil seks prøver per batch med gode resultater. Nylige forbedringer i robotdissosiatoren for å tillate parallell behandling av to prøver samtidig, vil muliggjøre behandling av 8-12 prøver per batch, noe som er kompatibelt med gjennomstrømningen av mikrofluidbrikken som brukes til enkeltkjerneinnkapsling.
Selv om vi ikke har brukt kjernene isolert av denne protokollen for andre nedstrømsapplikasjoner som ATAC-seq eller snRNAseq ved bruk av andre plattformer, basert på kvaliteten på data oppnådd med genuttrykksreagensene som brukes her, mener vi at protokollen vår skal være kompatibel med flere nedstrømsapplikasjoner. Imidlertid vil fremtidig arbeid innebære å teste denne protokollen med andre nedstrømsapplikasjoner, for eksempel ATAC-seq.
Avslutningsvis har vi utviklet en rask, enkel og delvis automatisert kjerneisolasjonsprotokoll for nedstrøms enkelt kjerne-RNA-sekvensering som har vist seg å være kompatibel med forskjellige typer frosne pattedyrvev.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble og Matthias Selhausen for å gi dyrevevet som ble analysert i dette manuskriptet. Vi vil også takke Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki og Martin Ebeling for deres bioinformatikkstøtte.
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |