使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑
Summary
本研究提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方案，并描述了分析正畸牙齿移动过程中牙槽骨重塑的方法，从而揭示了骨骼机械生物学。
Abstract
牙槽骨，周转率高，是人体重塑最活跃的骨骼。正畸牙齿移动 （OTM） 是一种常见的人工过程，即响应机械力进行牙槽骨重塑，但其潜在机制仍然难以捉摸。由于动物模型相关的限制，以往的研究无法揭示任何时间和空间骨重塑的确切机制。信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 在骨代谢中很重要，但其在 OTM 期间成骨细胞中的作用尚不清楚。为了提供 体内 证据证明 STAT3 在特定时间点参与 OTM，特别是在 OTM 期间参与细胞，我们生成了他莫昔芬诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠模型，施加正畸力，并分析牙槽骨表型。
显微计算机断层扫描（Micro-CT）和立体显微镜用于访问OTM距离。组织学分析选择位于上颌骨横截面第一磨牙（M1）三个根部内的区域作为感兴趣区域（ROI），评估成骨细胞和破骨细胞的代谢活性，表明正畸力对牙槽骨的影响。简而言之，我们提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠来研究正畸力下的骨重塑的方案，并描述了分析 OTM 期间牙槽骨重塑的方法，从而为骨骼机械生物学提供了新的思路。
Introduction
众所周知，根据沃尔夫定律1,2，骨骼在一生中不断进行重建，以响应机械力。适当的机械刺激，如重力和日常锻炼，通过刺激成骨细胞和破骨细胞来维持骨量和力量，并防止骨质流失。负责骨吸收的破骨细胞 3,4,5,6,7 和负责骨形成的成骨细胞 8,9,10 维持骨稳态并在骨重塑的生物过程中共同发挥作用。相反，在没有负荷刺激的情况下，如宇航员在长期微重力下，骨骼会遭受 10% 的骨密度损失，从而增加骨质疏松症的风险11,12。此外，非侵入性和方便的机械疗法，包括正畸和牵张成骨术，已成为骨骼疾病的治疗方法13,14。所有这些都表明，机械力在维持骨骼质量和数量方面起着至关重要的作用。最近的研究通常使用耗时的模型（例如跑轮和尾部悬架测试）分析响应机械负载的骨骼重塑，这些模型通常需要 4 周或更长时间来模拟力加载或卸载15,16。因此，需要一种方便高效的动物模型来研究受力载荷驱动的骨重塑。
牙槽骨在骨重塑方面最为活跃，周转率高17。牙齿正畸移位 （OTM） 是咬合不正的常见治疗方法，是一种响应机械力的牙槽骨重塑的人工过程。然而，与其他实验周期较长的模型相比，诱导快速骨重塑的OTM18也是一种节省时间的研究机械力对骨重塑影响的方法。因此，OTM是研究机械刺激下骨重塑的理想模型。值得注意的是，牙槽骨重塑的机制往往具有时效性，需要观察建模后某些时间点牙槽骨重塑的变化。具有DNA重组的时空调控和组织特异性的双重优势，诱导条件基因敲除小鼠模型是OTM研究的合适选择。
传统上，OTM介导的牙槽骨重塑分为涉及骨形成的张力区和涉及骨吸收的压力区19,20,21，这更详细但难以调节。此外，Yuri 等人报告说，OTM 中的骨形成时间在拉伸和压缩侧不同22。此外，先前的一项研究表明，第一磨牙可以在正畸力下启动上颌牙槽骨的广泛重塑，而正畸力不受张力和压力区的限制23。因此，我们选择位于上颌骨横截面 M1 三个根部内的区域作为感兴趣区域 （ROI），并描述了评估同一区域成骨细胞和破骨细胞活性的方法，以评估 OTM 下的牙槽骨重塑。
作为一种核转录因子，信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 已被证明在骨稳态中至关重要24,25。先前的研究报道了 Stat3 突变小鼠的低骨密度和复发性病理性骨折26,27。我们之前的研究表明，Osx+ 成骨细胞中 Stat3 的缺失会导致颅面畸形和骨质疏松症，以及自发性骨折28。最近，我们提供了诱导型成骨细胞特异性 Stat3 缺失小鼠模型 （Col1α2CreERT2;Stat3 fl/fl，以下称为 Stat3Col1α2ERT2），STAT3 在介导正畸力驱动牙槽骨重塑的影响中至关重要29.在这项研究中，我们提供了使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方法和方案，并描述了分析 OTM 过程中牙槽骨重塑的方法，从而阐明骨骼力学生物学。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于咬合不正是影响呼吸、咀嚼、说话甚至外观的最常见口腔疾病之一，因此对正畸的需求与日俱增，发病率从 70% 上升到 93%，根据之前的流行病学调查31,32。如何加速牙槽骨重塑，安全地提高正畸治疗效率，成为该领域的热点话题;因此，有必要阐明OTM驱动的牙槽骨重塑机制。在以往的研究中，研究人员利用体内药物注射来研究动物模型中OTM的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金（81870740、82071083、82271006、82101048、81800949）的部分资助;上海市自然科学基金资助项目（21ZR1436900， 22ZR1436700）;上海市学术/技术研究带头人计划（20XD1422300）;上海发展局临床研究计划（SHDC2020CR4084）;上海交通大学医学院附属第九人民医院交叉科研基金（JYJC201902、JYJC202116）;上海地方高水平高校创新研究团队（SSMUZLCX20180501）;研究学科基金编号上海交通大学医学院附属第九人民医院、上海交通大学口腔医学院KQYJXK2020;上海交通大学医学院附属第九人民医院原勘探项目（JYYC003）;上海交通大学医学院二百人才工程;上海交通大学医学院生物材料与再生医学研究院合作研究项目（2022LHB02）;上海交通大学医学院附属第九人民医院生物样本库项目（YBKB201909，YBKB202216）。
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
Riferimenti
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
