誘導性骨芽細胞系統特異的 Stat3 ノックアウトマウスを用いた歯列矯正歯の移動中の歯槽骨リモデリングの研究
Summary
本研究では、骨芽細胞系譜特異的 Stat3 ノックアウトマウスを用いて矯正力下での骨リモデリングを研究するためのプロトコールを提供し、歯列矯正歯の移動中の歯槽骨リモデリングの解析方法について記述し、骨格力学生物学に光を当てる。
Abstract
歯槽骨は、回転率が高く、体内で最も活発にリモデリングされている骨です。歯列矯正歯の移動(OTM)は、機械的な力に反応して歯槽骨をリモデリングする一般的な人工プロセスですが、根本的なメカニズムはとらえどころのないままです。これまでの研究では、動物モデルに関する制約により、いかなる時間的・空間的にも骨のリモデリングの正確なメカニズムを明らかにすることができませんでした。シグナル伝達因子および転写活性化因子3(STAT3)は骨代謝に重要であるが、OTM中の骨芽細胞におけるその役割は不明である。STAT3が特定の時点で、OTM中の特定の細胞でOTMに関与しているという in vivo の証拠を提供するために、タモキシフェン誘導性骨芽細胞系統特異的 Stat3 ノックアウトマウスモデルを作成し、歯列矯正力を適用し、歯槽骨表現型を分析しました。
マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)と実体顕微鏡を使用して、OTM距離にアクセスしました。組織学的解析により、上顎骨断面の第1大臼歯(M1)の3根以内に位置する領域を関心領域(ROI)として選択し、骨芽細胞と破骨細胞の代謝活性を評価し、歯槽骨に対する矯正力の影響を示しました。要するに、我々は、誘導可能な骨芽細胞系統特異的 Stat3 ノックアウトマウスを使用して、歯列矯正力下での骨リモデリングを研究し、OTM中の歯槽骨リモデリングを解析する方法を説明し、骨格力学生物学に新たな光を当てるプロトコルを提供します。
Introduction
骨は、ウォルフの法則1,2に従って機械的力に反応して、生涯を通じて絶え間なく再建されることが一般的に知られています。重力や日常的な運動などの適切な機械的刺激は、骨芽細胞と破骨細胞の両方を刺激することで、骨量と強度を維持し、骨量の減少を防ぎます。骨吸収3,4,5,6,7を担う破骨細胞と骨形成8,9,10を担う骨芽細胞は、骨の恒常性を維持し、骨リモデリングの生物学的プロセスにおいて共同で機能する。対照的に、長期間の微小重力下での宇宙飛行士のように、負荷刺激がない場合、骨は10%の骨密度喪失を被り、骨粗鬆症のリスクが高まります11,12。さらに、歯列矯正や伸展骨形成などの非侵襲的で便利な機械的治療が、骨疾患の治療法として登場しています13,14。これらはすべて、機械的な力が骨の質と量を維持する上で重要な役割を果たしていることを示しています。最近の研究では、一般的に、力の負荷または除荷をシミュレートするのに通常4週間以上かかるランニングホイールやテールサスペンションテストなどの時間のかかるモデルを使用して、機械的負荷に応答する骨のリモデリングを分析しました15,16。そのため、力負荷による骨のリモデリングを研究するための簡便で効率的な動物モデルが求められています。
歯槽骨は骨のリモデリングの点で最も活発で、高い代謝回転率17。不正咬合の一般的な治療法である歯列矯正歯の移動(OTM)は、機械的な力に反応して歯槽骨をリモデリングする人工的なプロセスです。しかし、迅速な骨リモデリングを誘導するOTM18は、実験期間の長い他のモデルと比較して、骨リモデリングに対する機械的力の影響を研究するための時間を節約する方法でもある。したがって、OTMは機械的刺激下での骨のリモデリングを研究するための理想的なモデルです。歯槽骨リモデリングのメカニズムは時間的制約を受けることが多く、モデリング後のある時点で歯槽骨リモデリングの変化を観察する必要があることは注目に値します。DNA組換えと組織特異性の時間的および空間的制御という2つの利点を持つ誘導性条件付き遺伝子ノックアウトマウスモデルは、OTM研究に適しています。
従来、OTMを介した歯槽骨リモデリングは、骨形成を伴う緊張ゾーンと骨吸収を伴う圧迫ゾーンに分けられてきた19,20,21が、より詳細であるが調節が困難である。さらに、Yuriらは、OTMにおける骨形成の時期が張力側と圧迫側で異なることを報告した22。さらに、以前の研究では、第1大臼歯が上顎歯槽骨の広いリモデリングを開始できることが実証されていました 歯列矯正力の下で、それは張力と圧力ゾーンに制約されていませんでした23。そこで、上顎骨断面のM1根3根以内に位置する領域を関心領域(ROI)として選択し、OTM下で歯槽骨リモデリングを評価するために、同じ領域の骨芽細胞と破骨細胞の活性を評価する方法を記載した。
核転写因子として、シグナル伝達因子および転写活性化因子3(STAT3)は、骨の恒常性維持に重要であることが証明されています24,25。以前の研究では、Stat3変異マウスの骨塩密度の低下と再発性の病理学的骨折が報告されています26,27。以前の研究では、Osx +骨芽細胞におけるStat3の欠失が頭蓋顔面奇形と骨粗鬆症、および自然骨折を引き起こすことが示されました28。最近、誘導性骨芽細胞特異的Stat3欠失マウスモデル(Col1α2CreERT2;Stat3 fl/fl、以下Stat3Col1α2ERT2と呼ぶ)は、STAT3が歯槽骨リモデリングを駆動する歯列矯正力の効果を媒介する上で重要であることを示している29。本研究では、骨芽細胞系譜特異的Stat3ノックアウトマウスを用いて、歯列矯正力下での骨リモデリングを研究するための方法とプロトコールを提供し、OTM中の歯槽骨リモデリングの解析方法について記述し、骨格力学生物学に光を当てる。
Protocol
Representative Results
Discussion
不正咬合は、呼吸、咀嚼、発話、さらには外見を損なう最も一般的な口腔疾患の1つであるため、歯列矯正の需要は日々増加しており、以前の疫学調査によると、発生率は70%から93%に上昇しています31,32。歯槽骨リモデリングをいかに加速し、安全に矯正治療の効率を上げるかが、この分野で話題になっています。そのため、OTMによる歯槽骨リモデ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、中国国家自然科学基金会(81870740、82071083、82271006、82101048、81800949)からの助成金によって支援されました。上海自然科学基金会(21ZR1436900、22ZR1436700);上海学術/技術研究リーダー(20XD1422300)のプログラム。SHDCの臨床研究計画(SHDC2020CR4084);上海交通大学医学部上海第九人民病院の学際的研究基金(JYJC201902、JYJC202116);上海のハイレベル地方大学のイノベーション研究チーム(SSMUZLCX20180501);研究規律基金番号。上海交通大学医学部第九人民病院および上海交通大学口腔病学院KQYJXK2020。上海交通大学医学部上海第九人民病院のオリジナル探査プロジェクト(JYYC003);上海交通大学医学部の200人の才能プロジェクト。上海交通大学医学部生体材料・再生医療研究所共同研究プロジェクト(2022LHB02);上海交通大学医学部上海第九人民病院バイオバンクプロジェクト(YBKB201909年、YBKB202216年)。
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
Riferimenti
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
