Användning av inducerbara osteoblastiska härstamningsspecifika Stat3 knockout-möss för att studera alveolär benremodellering under ortodontisk tandrörelse
Summary
Denna studie ger ett protokoll för att använda inducerbara osteoblast-linjespecifika Stat3 knockout-möss för att studera benremodellering under ortodontisk kraft och beskriver metoder för att analysera alveolär benremodellering under ortodontisk tandrörelse, vilket belyser skelettmekanisk biologi.
Abstract
Det alveolära benet, med hög omsättningshastighet, är det mest aktivt omformande benet i kroppen. Ortodontisk tandrörelse (OTM) är en vanlig konstgjord process för alveolär benombyggnad som svar på mekanisk kraft, men den underliggande mekanismen är fortfarande svårfångad. Tidigare studier har inte kunnat avslöja den exakta mekanismen för benremodellering i någon tid och rum på grund av djurmodellrelaterade restriktioner. Signalomvandlaren och aktivatorn för transkription 3 (STAT3) är viktig för benmetabolismen, men dess roll i osteoblaster under OTM är oklar. För att ge in vivo-bevis för att STAT3 deltar i OTM vid specifika tidpunkter och i särskilda celler under OTM, genererade vi en tamoxifen-inducerbar osteoblast-linjespecifik Stat3 knockout-musmodell, applicerade ortodontisk kraft och analyserade den alveolära benfenotypen.
Mikrodatortomografi (Micro-CT) och stereomikroskopi användes för att komma åt OTM-avstånd. Histologisk analys valde området som ligger inom tre rötter av den första molaren (M1) i tvärsnittet av maxillärbenet som intresseområde (ROI) för att utvärdera den metaboliska aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster, vilket indikerar effekten av ortodontisk kraft på alveolarbenet. I korthet tillhandahåller vi ett protokoll för att använda inducerbara osteoblast-linjespecifika Stat3 knockout-möss för att studera benremodellering under ortodontisk kraft och beskriva metoder för att analysera alveolär benremodellering under OTM, vilket kastar nytt ljus över skelettmekanisk biologi.
Introduction
Det är allmänt känt att ben är under ständig rekonstruktion under hela livet, som svar på mekaniska krafter enligt Wolffs lag 1,2. Lämplig mekanisk stimulering, såsom gravitation och daglig motion, bibehåller benmassa och styrka och förhindrar benförlust genom att stimulera både osteoblaster och osteoklaster. Osteoklaster, som ansvarar för benresorption3,4,5,6,7, och osteoblaster, som ansvarar för benbildning 8,9,10, upprätthåller benhomeostas och fungerar gemensamt i den biologiska processen för benombyggnad. Däremot, i frånvaro av belastningsstimuli, som hos astronauter under långvarig mikrogravitation, drabbas benen av 10 % förlust av bentäthet, vilket ökar risken för osteoporos11,12. Dessutom har icke-invasiva och bekväma mekaniska terapier, inklusive ortodonti och distraktionsosteogenes, dykt upp som behandlingar för bensjukdomar13,14. Alla dessa har visat att mekanisk kraft spelar en avgörande roll för att upprätthålla benkvalitet och kvantitet. Nyligen genomförda studier analyserade i allmänhet benremodellering som svar på mekanisk belastning med hjälp av tidskrävande modeller som löphjuls- och svansfjädringstester, som vanligtvis tog 4 veckor eller mer för att simulera kraftbelastning eller avlastning15,16. Därför finns det en efterfrågan på en bekväm och effektiv djurmodell för att studera benombyggnad som drivs av kraftbelastning.
Det alveolära benet är det mest aktiva när det gäller benombyggnad, med en hög omsättningshastighet17. Ortodontisk tandrörelse (OTM), en vanlig behandling för bettfel, är en konstgjord process för alveolär benombyggnad som svar på mekanisk kraft. Men OTM, som inducerar snabb benremodellering18, är också ett tidsbesparande sätt att studera effekterna av mekanisk kraft på benremodellering jämfört med andra modeller med lång experimentperiod. Därför är OTM en idealisk modell för att studera benombyggnad under mekaniska stimuli. Det är anmärkningsvärt att mekanismen för alveolär benremodellering ofta är tidskänslig, och det är nödvändigt att observera förändringarna i alveolär benremodellering vid vissa tidpunkter efter modellering. Med de dubbla fördelarna med tidsmässig och rumslig kontroll av DNA-rekombination och vävnadsspecificitet är en inducerbar betingad genknockoutmusmodell ett lämpligt val för OTM-studier.
Konventionellt har OTM-medierad alveolär benremodellering delats in i spänningszoner som involverar benbildning och tryckzoner som involverar benresorption 19,20,21, vilket är mer detaljerat men svårt att reglera. Vidare rapporterade Yuri et al. att tiden för benbildning vid OTM skilde sig åt på spännings- och kompressionssidan22. Dessutom hade en tidigare studie visat att den första kindtanden kunde initiera en bred ombyggnad av det maxillära alveolära benet under ortodontisk kraft, som inte var begränsad till spännings- och tryckzonerna23. Därför valde vi området som ligger inom tre rötter av M1 i tvärsnittet av maxillärbenet som intresseområde (ROI) och beskrev metoder för att bedöma aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster i samma område för att utvärdera alveolär benremodellering under OTM.
Som en nukleär transkriptionsfaktor har signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3) visat sig vara avgörande för benhomeostas24,25. Tidigare studier har rapporterat låg bentäthet och återkommande patologiska frakturer hos Stat3-muterade möss26,27. Vår tidigare studie visade att deletion av Stat3 i Osx+ osteoblaster orsakade kraniofaciala missbildningar och osteoporos, samt spontana benfrakturer28. Nyligen tillhandahöll vi in vivo-bevis med en inducerbar osteoblastspecifik Stat3-deletionsmusmodell (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, hädanefter kallad Stat3Col1α2ERT2) att STAT3 är avgörande för att förmedla effekterna av ortodontisk kraft som driver alveolär benombyggnad29. I denna studie tillhandahåller vi metoder och protokoll för att använda inducerbara osteoblast-linjespecifika Stat3 knockout-möss för att studera benremodellering under ortodontisk kraft och beskriva metoder för att analysera alveolär benremodellering under OTM, vilket belyser skelettmekanisk biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom bettfel är en av de vanligaste orala störningarna som försämrar andning, tuggning, tal och till och med utseende, ökar efterfrågan på ortodonti dag för dag och incidensen ökar från 70 % till 93 % enligt en tidigare epidemiologisk undersökning31,32. Hur man påskyndar alveolär benombyggnad för att öka effektiviteten av ortodontisk behandling på ett säkert sätt har blivit ett hett ämne inom detta område; därför är det nödvändigt att…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Shanghais naturvetenskapliga stiftelse (21ZR1436900, 22ZR1436700); programmet för Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); SHDC:s kliniska forskningsplan (SHDC2020CR4084). den tvärvetenskapliga forskningsfonden vid Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); Innovationsforskningsgruppen vid lokala högnivåuniversitet i Shanghai (SSMUZLCX20180501). Vetenskapsområdesfonden nr. KQYJXK2020 från Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine och College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Ursprungligt prospekteringsprojekt vid Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Tvåhundra talangprojekt vid Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; det kooperativa forskningsprojektet Biomaterials and Regenerative Medicine Institute, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); projektet för biobank vid Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
Riferimenti
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
