JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Ortodontik Diş Hareketi Sırasında Alveolar Kemiğin Yeniden Şekillenmesini İncelemek için İndüklenebilir Osteoblastik Soya Özgü Stat3 Nakavt Farelerinin Kullanılması

Published: July 21, 2023
doi:
10.3791/65613
, , , , , , , , , , , , , ,
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology,Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

Bu çalışma, ortodontik kuvvet altında kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerin kullanılması için bir protokol sağlar ve ortodontik diş hareketi sırasında alveolar kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etme yöntemlerini açıklar, böylece iskelet mekanik biyolojisine ışık tutar.

Abstract

Yüksek devir hızına sahip alveol kemiği, vücuttaki en aktif şekilde yeniden şekillenen kemiktir. Ortodontik diş hareketi (OTM), mekanik kuvvete yanıt olarak alveolar kemiğin yeniden şekillenmesinin yaygın bir yapay işlemidir, ancak altta yatan mekanizma belirsizliğini korumaktadır. Önceki çalışmalar, hayvan modeliyle ilgili kısıtlamalar nedeniyle herhangi bir zaman ve mekanda kemiğin yeniden şekillenmesinin kesin mekanizmasını ortaya çıkaramamıştır. Transkripsiyon 3’ün (STAT3) sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü kemik metabolizmasında önemlidir, ancak OTM sırasında osteoblastlardaki rolü belirsizdir. STAT3’ün OTM’ye belirli zaman noktalarında ve OTM sırasında belirli hücrelere katıldığına dair in vivo kanıt sağlamak için, tamoksifen ile indüklenebilir osteoblast soyuna özgü bir Stat3 nakavt fare modeli oluşturduk, ortodontik kuvvet uyguladık ve alveolar kemik fenotipini analiz ettik.

Mikrobilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) ve stereo mikroskopi kullanılarak OTM mesafesi sağlandı. Histolojik analiz, ortodontik kuvvetin alveolar kemik üzerindeki etkisini gösteren osteoblastların ve osteoklastların metabolik aktivitesini değerlendirmek için maksiller kemiğin enine kesitinde birinci azı dişinin (M1) üç kökü içinde yer alan alanı ilgilenilen bölge (ROI) olarak seçti. Kısacası, ortodontik kuvvet altında kemik yeniden şekillenmesini incelemek ve OTM sırasında alveolar kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etmek için yöntemleri tanımlamak için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt fareleri kullanmak için bir protokol sunuyoruz, böylece iskelet mekanik biyolojisine yeni bir ışık tutuyoruz.

Introduction

Wolff yasası 1,2’ye göre mekanik kuvvetlere yanıt olarak kemiğin yaşam boyunca sürekli yeniden yapılanma altında olduğu genel olarak bilinmektedir. Yerçekimi ve günlük egzersiz gibi uygun mekanik stimülasyon, kemik kütlesini ve gücünü korur ve hem osteoblastları hem de osteoklastları uyararak kemik kaybını önler. Kemik rezorpsiyonundan sorumlu osteoklastlar 3,4,5,6,7 ve kemik oluşumundan sorumlu osteoblastlar 8,9,10, kemik homeostazını korur ve kemiğin yeniden şekillenmesinin biyolojik sürecinde birlikte işlev görür. Buna karşılık, uzun süreli mikro yerçekimi altındaki astronotlarda olduğu gibi, yükleme uyaranlarının yokluğunda, kemikler %10 kemik mineral yoğunluğu kaybına uğrar ve böylece osteoporoz riskini artırır11,12. Ayrıca, ortodonti ve distraksiyon osteogenezisi de dahil olmak üzere noninvaziv ve uygun mekanik tedaviler kemik hastalıklarının tedavileri olarak ortaya çıkmıştır13,14. Bütün bunlar, mekanik kuvvetin kemik kalitesini ve miktarını korumada kritik bir rol oynadığını göstermiştir. Son çalışmalar genellikle, kuvvet yükleme veya boşaltmayı simüle etmek için genellikle 4 hafta veya daha fazla süren koşu tekerleği ve kuyruk süspansiyon testleri gibi zaman alıcı modeller kullanılarak mekanik yüklemeye yanıt olarak kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etti15,16. Bu nedenle, kuvvet yüklemesi tarafından yönlendirilen kemik yeniden şekillenmesini incelemek için uygun ve verimli bir hayvan modeline talep vardır.

Alveolar kemik, yüksek devir hızı ile kemiğin yeniden şekillenmesi açısından en aktif olanıdır17. Maloklüzyon için yaygın bir tedavi olan ortodontik diş hareketi (OTM), mekanik kuvvete yanıt olarak yapay bir alveol kemiği yeniden şekillenme işlemidir. Bununla birlikte, hızlı kemik yeniden şekillenmesini18 indükleyen OTM, aynı zamanda, uzun bir deney periyoduna sahip diğer modellere kıyasla mekanik kuvvetin kemik yeniden şekillenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için zaman kazandıran bir yoldur. Bu nedenle, OTM, mekanik uyaranlar altında kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için ideal bir modeldir. Alveol kemiğinin yeniden şekillenme mekanizmasının genellikle zamana duyarlı olması dikkat çekicidir ve modellemeden sonra belirli zaman noktalarında alveol kemiğinin yeniden şekillenmesindeki değişiklikleri gözlemlemek gerekir. DNA rekombinasyonunun ve doku özgüllüğünün zamansal ve uzamsal kontrolünün ikili avantajları ile, indüklenebilir koşullu gen nakavt fare modeli, OTM çalışmaları için uygun bir seçimdir.

Geleneksel olarak, OTM aracılı alveolar kemik yeniden şekillenmesi, kemik oluşumunu içeren gerilim bölgelerine ve kemik rezorpsiyonunu içeren basınç bölgelerine ayrılmıştır 19,20,21, bu daha ayrıntılı ancak düzenlenmesi zordur. Ayrıca Yuri ve ark. OTM’de kemik oluşum zamanının gerilim ve kompresyon taraflarında farklılık gösterdiğini bildirmişlerdir22. Ek olarak, daha önce yapılan bir çalışma, birinci azı dişinin, ortodontik kuvvet altında maksiller alveolar kemiğin geniş bir şekilde yeniden şekillenmesini başlatabildiğini ve bunun gerginlik ve basınç bölgeleriyle sınırlı olmadığını göstermiştir23. Bu nedenle, maksiller kemiğin enine kesitinde M1’in üç kökü içinde yer alan alanı ilgilenilen bölge (ROI) olarak seçtik ve OTM altında alveolar kemik yeniden şekillenmesini değerlendirmek için aynı bölgedeki osteoblastların ve osteoklastların aktivitesini değerlendirmek için yöntemler tanımladık.

Bir nükleer transkripsiyon faktörü olarak, sinyal transdüseri ve transkripsiyon 3’ün aktivatörünün (STAT3) kemik homeostazında kritik olduğu kanıtlanmıştır24,25. Önceki çalışmalar, Stat3-mutant farelerde düşük kemik mineral yoğunluğu ve tekrarlayan patolojik kırıklar bildirmiştir26,27. Önceki çalışmamız, Osx + osteoblastlarında Stat3 silinmesinin kraniyofasiyal malformasyon ve osteoporozun yanı sıra spontan kemik kırığına neden olduğunu göstermiştir28. Son zamanlarda, indüklenebilir osteoblasta özgü bir Stat3 delesyon fare modeli (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, bundan sonra Stat3Col1α2ERT2 olarak anılacaktır) STAT3’ün ortodontik kuvveti tahrik eden alveolar kemiğin yeniden şekillenmesinin etkilerine aracılık etmede kritik olduğunu29. Bu çalışmada, ortodontik kuvvet altında kemik yeniden şekillenmesini incelemek için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerin kullanımına yönelik yöntemler ve protokoller sunuyoruz ve OTM sırasında alveolar kemik yeniden şekillenmesini analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz, böylece iskelet mekanik biyolojisine ışık tutuyoruz.

Protocol

Burada açıklanan hayvanları içeren tüm yöntemler, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (no. 82101048) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. İndüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerinin oluşturulması NOT: Stat3 fl/fl fareler ticari olarak elde edilmiştir; Col1α2CreERT2suşu bir hediyeydi (tüm ayrıntılar için <stro…

Representative Results

Bu protokolü kullanarak, STAT3 delesyonunun ortodontik kuvvete dayalı alveolar kemik yeniden şekillenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için indüklenebilir bir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt fare (Stat3Col1α2ERT2) modeli oluşturduk (Şekil 1A,B). Osteoblastlarda STAT3 delesyonu, alveolar kemiğin immünofloresan boyaması ile doğrulandı (Şekil 1C). Stereo mikroskopi, WT…

Discussion

Maloklüzyon nefes almayı, çiğnemeyi, konuşmayı ve hatta görünümü bozan en yaygın oral bozukluklar arasında yer aldığından, ortodontiye olan talep her geçen gün artmaktadır ve daha önceki bir epidemiyolojik araştırmaya göre görülme sıklığı %70’ten %93’e yükselmektedir31,32. Ortodontik tedavinin etkinliğini güvenli bir şekilde artırmak için alveolar kemik yeniden şekillenmesinin nasıl hızlandırılacağı bu alanda sıcak bir ko…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Şanghay Doğa Bilimleri Vakfı (21ZR1436900, 22ZR1436700); Şangay Akademik/Teknoloji Araştırma Lideri Programı (20XD1422300); SHDC Klinik Araştırma Planı (SHDC2020CR4084); Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi Disiplinlerarası Araştırma Fonu (JYJC201902, JYJC202116); Şanghay’daki Üst Düzey Yerel Üniversitelerin İnovasyon Araştırma Ekibi (SSMUZLCX20180501); Araştırma Disiplin Fonu no. Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Stomatoloji Fakültesi’nden KQYJXK2020; Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (JYYC003) Orijinal Keşif Projesi; Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi’nin İki Yüz Yetenek Projesi; Biyomalzemeler ve Rejeneratif Tıp Enstitüsü Ortak Araştırma Projesi Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (2022LHB02); Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Biobank Projesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Tags

Keywords: Alveolar Bone RemodelingOrthodontic Tooth MovementSTAT3Inducible Osteoblastic Lineage-specific Knockout MiceMicro-CTBone Metabolism
check_url/it/65613?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image