Il presente protocollo descrive una strategia completa per valutare l'azione farmacologica e il meccanismo del salidroside nell'inibire la proliferazione e la migrazione delle cellule MCF-7.
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Articolo metodologico
Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il salidroside (Sal) contiene attività farmacologiche anticancerogene, antiipossiche e antinfiammatorie. Tuttavia, i suoi meccanismi anti-cancro al seno sono stati chiariti solo in modo incompleto. Quindi, questo protocollo intendeva decodificare il potenziale di Sal nella regolazione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 nella proliferazione maligna delle cellule MCF-7 del carcinoma mammario umano. In primo luogo, l'attività farmacologica di Sal contro MCF-7 è stata valutata mediante CCK-8 e saggi di graffio cellulare. Inoltre, la resistenza delle cellule MCF-7 è stata misurata mediante saggi di migrazione e invasione di Matrigel. Per l'apoptosi cellulare e i saggi del ciclo, le cellule MCF-7 sono state processate in fasi con annessina V-FITC/PI e kit di rilevamento della colorazione del ciclo cellulare per le analisi di citometria a flusso, rispettivamente. I livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e Ca2+ sono stati esaminati mediante colorazione a immunofluorescenza DCFH-DA e Fluo-4 AM. Le attività di Na+-K+-ATPasi e Ca2+-ATPasi sono state determinate utilizzando i corrispondenti kit commerciali. I livelli di espressione proteica e genica nell'apoptosi e nella via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sono stati ulteriormente determinati utilizzando analisi western blot e qRT-PCR, rispettivamente. Abbiamo scoperto che il trattamento con Sal ha limitato significativamente la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 con effetti dose-dipendenti. Nel frattempo, la somministrazione di Sal ha anche drammaticamente costretto le cellule MCF-7 a subire l'apoptosi e l'arresto del ciclo cellulare. I test di immunofluorescenza hanno mostrato che Sal stimolava in modo osservabile la produzione di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7. Ulteriori dati hanno confermato che Sal ha promosso i livelli di espressione delle proteine pro-apoptotiche, Bax, Bim, caspasi scissa-9/7/3 e dei loro geni corrispondenti. Coerentemente, l'intervento di Sal ha ridotto in modo prominente l'espressione delle proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e dei loro geni corrispondenti. In conclusione, Sal può essere utilizzato come potenziale composto derivato da erbe per il trattamento del cancro al seno, in quanto può ridurre la proliferazione maligna, la migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 inibendo la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduzione
Essendo uno dei tumori più comunemente diagnosticati e delle neoplasie maligne più comuni, le ultime statistiche indicano che 2,3 milioni di casi di cancro al seno sono emersi in tutto il mondo entro il 2020, pari all'11,7% di tutti i casi di cancro1. I sintomi comuni del cancro al seno includono tensione mammaria e formicolio, noduli e dolore al seno, secrezione dal capezzolo, erosione o pelle infossata e linfonodi ascellari ingrossati 1,2. Ancora più allarmante, il numero di nuovi casi e l'incidenza complessiva del cancro al seno continuano ad aumentare a un ritmo schiacciante ogni an....
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Protocollo
Le cellule MCF-7 utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali).
1. Colture cellulari
- Coltura delle cellule MCF-7 in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C con DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina (10.000 U/mL)/streptomicina (10.000 μg/mL) (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Le cellule che coprono il 90% del fondo del piatto sono state impiegate per l'esperimento e assegnate ai seguenti gruppi: gruppo di controllo, gruppo cloridrato doxorubicina (DXR, 5 μM) e gruppi Sal (20 μM,....
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Risultati
Effetti del Sal sull'inibizione dell'eccesso di proliferazione e sul ritardo della guarigione delle ferite nelle cellule MCF-7
Per sondare il potenziale di Sal contro il cancro al seno, abbiamo prima testato le sue proprietà antitumorali utilizzando la tossicità della proliferazione cellulare e i saggi di graffio della linea cellulare MCF-7 del cancro al seno umano. Queste cellule sono state co-incubate con una serie di concentrazioni di Sal (5-320 μM) per 24 ore e la proliferazione cellulare è stata .......
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Discussione
Il cancro al seno colpisce individui di tutte le età e provoca un carico fisico e mentale incalcolabile e una grande pressione economica1. Il cancro al seno, con la sua morbilità e mortalità che aumentano ogni anno, ha anche attirato l'attenzione mondiale in termini di ricerca di terapie composte efficaci a base di erbe al di là dei trattamenti convenzionali 4,5. Promettentemente, un ampio corpo di prove ha rivelato gli effetti antitumoral.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione sanitaria della provincia di Sichuan (120025).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1% penicillina/streptomicina | HyClone | SV30010 | |
| anticorpo AKT | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Lettore automatico di micropiastre | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax anticorpo | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| Kit BCA | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 anticorpo | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| anticorpale Bim | , Inc. | #2933 | |
| Ca2+– Kit per il dosaggio dell'ATPasi | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Kit per il conteggio delle cellule-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Kit per la colorazione del ciclo cellulare | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| caspasi-3 scissa | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| caspasi scissa-7 | Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc. | #8438 | |
| caspasi scissa-9 | Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc. | #20750 | |
| Soluzione di cristallovioletto | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM terreno di coltura ad alto glucosio | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicina cloridrato | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL soluzione chemiluminescente | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Siero fetale bovino | Procell Life Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Citometro | a flusso BD | FACSCanto  | |
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 anticorpo | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Capra anti-coniglio IgG anticorpo secondario | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Versione 6.0 | |
| HIF-1α anticorpo | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Linea cellulare di carcinoma mammario umano MCF-7 | Procell Life Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Tampone di carico | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | ||
| anticorpo mTOR | Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| Na+– K+– Kit di dosaggio dell'ATPasi | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Microscopio ottico | Anticorpo Olympus | IX71PH | |
| p-AKT | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| Anticorpo PI3K | Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| p-PI3K anticorpo | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Sistema di imaging Western blot quantitativo | Image Pro | eBlot | |
| Kit di sintesi del cDNA del primo filamento a trascrizione inversa | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| sonda a fluorescenza DCFH-DA | Beyotime Biotechnology | S0033S | |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | Kit H-040 | |
| SDS-PAGE | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Foregene | RE-03014 | ||
| Tripsina | HyClone | SH30042.01 | |
| β- | actina Affinità Biosciences | AF7018 |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al.
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Ristampe e permessi
