Protokollen viser gjentatte cerebrospinalvæsker og blodansamlinger fra epileptikere utført parallelt med kontinuerlig monitorering av video-elektroencefalogram (EEG). Disse er medvirkende til å utforske mulige koblinger mellom endringer i forskjellige kroppsvæskemolekyler og anfallsaktivitet.
Fordi sammensetningen av kroppsvæsker gjenspeiler mange fysiologiske og patologiske dynamikker, blir biologiske væskeprøver ofte oppnådd i mange eksperimentelle sammenhenger for å måle molekyler av interesse, for eksempel hormoner, vekstfaktorer, proteiner eller små ikke-kodende RNA. Et spesifikt eksempel er prøvetaking av biologiske væsker i forskningen av biomarkører for epilepsi. I disse studiene er det ønskelig å sammenligne nivåene av molekyler i cerebrospinalvæsken (CSF) og i plasma, ved å trekke CSF og plasma parallelt og vurdere tidsavstanden til prøvetakingen fra og til anfall. Den kombinerte CSF- og plasmaprøvetakingen, kombinert med video-EEG-overvåking hos epileptiske dyr, er en lovende tilnærming for validering av antatte diagnostiske og prognostiske biomarkører. Her beskrives en prosedyre med kombinert CSF-seponering fra cisterna magna og blodprøvetaking fra laterale haleven hos epileptiske rotter som kontinuerlig overvåkes av video-EEG. Denne prosedyren gir betydelige fordeler i forhold til andre vanlige teknikker. Det tillater rask prøvetaking med minimal smerte eller invasivitet, og redusert anestesitid. I tillegg kan den brukes til å oppnå CSF- og plasmaprøver i både bundet og telemetri EEG-registrerte rotter, og den kan brukes gjentatte ganger over flere dager med eksperiment. Ved å minimere belastningen på grunn av prøvetaking ved å forkorte isoflurananestesi, forventes tiltak å reflektere mer nøyaktig de sanne nivåene av undersøkte molekyler i biofluider. Avhengig av tilgjengeligheten av en passende analytisk analyse, kan denne teknikken brukes til å måle nivåene av flere, forskjellige molekyler mens du utfører EEG-opptak samtidig.
Cerebrospinalvæske (CSF) og blodprøvetaking er viktig for å identifisere og validere biomarkører for epilepsi, både i preklinisk og klinisk forskning 1,2. I dag fokuserer diagnosen epilepsi og det meste av forskningen på epilepsibiomarkører på EEG og neuroimaging 3,4,5. Disse tilnærmingene presenterer imidlertid flere begrensninger. Bortsett fra rutinemessige hodebunnsmålinger, krever EEG i mange tilfeller invasive teknikker som dybdeelektroder6. Hjerneavbildningsmetoder har dårlig tidsmessig og romlig oppløsning og er relativt dyre og tidkrevende 7,8. Av denne grunn vil identifisering av ikke-invasive, lave kostnader og biofluidbaserte biomarkører gi et svært attraktivt alternativ. I tillegg kan disse biofluidbiomarkørene kombineres med tilgjengelige diagnostiske tilnærminger for å skjerpe deres prediktivitet.
Pasienter diagnostisert med epilepsi blir rutinemessig sendt til EEG 9,10 og blodprøvetaking 11,12,13,14, og mange også til CSF-abstinens for å utelukke livstruende årsaker (dvs. akutte infeksjoner, autoimmun encefalitt)15. Disse blod- og CSF-prøvene kan brukes i klinisk forskning med sikte på å identifisere biomarkører for epilepsi. For eksempel har Hogg og medarbeidere funnet at en økning i tre plasma tRNA-fragmenter går foran anfallsforekomst i human epilepsi14. Tilsvarende kan interleukin-1beta (IL-1β) nivåer i humant CSF og serum, uttrykt som forholdet mellom IL-1β-nivåer i CSF over serum, forutsi posttraumatisk epilepsiutvikling etter traumatisk hjerneskade16. Disse studiene fremhever viktigheten av biofluidprøvetaking for epilepsibiomarkørforskning, men de står overfor flere begrensninger som er iboende for kliniske studier, for eksempel den medstiftende faktoren for antiepileptika (AED) i blod, den hyppige mangelen på etiologiinformasjon, utilstrekkelige kontroller, beskjedent antall pasienter og andre17,18.
Preklinisk forskning gir andre muligheter for å undersøke molekyler i biofluider som potensielle biomarkører for epilepsi. Det er faktisk mulig å trekke plasma og/eller CSF fra dyr mens du utfører EEG-registreringer. Videre kan prøvetaking utføres gjentatte ganger over flere dager av forsøket, og en rekke alder, kjønn og epileptiske fornærmelsesmatchede kontroller kan brukes til å forbedre studiens robusthet. Her beskrives en fleksibel teknikk for å oppnå CSF fra cisterna magna med parallell seponering av plasma fra halevenen hos EEG-monitorerte rotter i detalj. Den presenterte teknikken har flere fordeler i forhold til alternative metoder. Ved å bruke en sommerfuglnåltilnærming, er det mulig å samle CSF flere ganger uten at det går ut over funksjonen til EEG-elektroder eller lignende hodeimplantater. Dette representerer en forbedring av intratekale kateterabstinensprosedyrer, som er forbundet med en relativt høy infeksjonsrisiko. I tillegg er den rapporterte fritt fallfall-tilnærmingen som brukes til blodoppsamling, overlegen andre tilnærminger til tilbaketrekking av blod i halevene på grunn av den sterkt reduserte risikoen for hemolyse, på grunn av at blod ikke passerer gjennom slangen og ingen vakuumtrykk påføres. Hvis det utføres under strenge bakteriefrie forhold, er det spesielt lav risiko for infeksjon for dyr. I tillegg, ved å starte bloduttakene i enden av dyrets haler, kan prøvetaking gjentas flere ganger. Slike teknikker er enkle å mestre og kan brukes i mange prekliniske studier av sykdommer i sentralnervesystemet.
Det nåværende arbeidet illustrerer en lett-å-mestre teknikk for CSF og blodinnsamling hos rotter, noe som kan være nyttig ikke bare for studier i modeller av epilepsi, men også av andre nevrologiske tilstander eller sykdommer som Alzheimer, Parkinson eller multippel sklerose. I epilepsiforskning er begge prøvetakingsprosedyrene kombinert med video-EEG ideelle når det forfølges en sammenheng mellom nivåene av forskjellige løselige molekyler og anfallsaktivitet. Av denne spesifikke grunnen ble det benyttet et kon…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av et tilskudd fra EUs Horizon 2020 Work Programme (ring H2020-FETOPEN-2018-2020) under tilskuddsavtale 964712 (PRIME; til M. Simonato).
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |