EEG Kayıtları Sırasında Sıçanlarda Lateral Kuyruk Veninden Beyin Omurilik Sıvısı ve Kan Örneği Alınması
Summary
Protokol, sürekli video-elektroensefalogram (EEG) monitörizasyonuna paralel olarak gerçekleştirilen epileptik sıçanlardan tekrarlanan beyin omurilik sıvısı ve kan alımlarını gösterir. Bunlar, çeşitli vücut sıvısı moleküllerindeki değişiklikler ile nöbet aktivitesi arasındaki olası bağlantıları araştırmak için etkilidir.
Abstract
Vücut sıvılarının bileşimi birçok fizyolojik ve patolojik dinamiği yansıttığından, hormonlar, büyüme faktörleri, proteinler veya küçük kodlamayan RNA’lar gibi ilgilenilen molekülleri ölçmek için birçok deneysel bağlamda biyolojik sıvı örnekleri yaygın olarak elde edilir. Spesifik bir örnek, epilepsi için biyobelirteçlerin araştırılmasında biyolojik sıvıların örneklenmesidir. Bu çalışmalarda, beyin omurilik sıvısındaki (BOS) ve plazmadaki molekül düzeylerinin, BOS ve plazmayı paralel olarak geri çekerek ve örneklemenin nöbetlerden ve nöbetlere olan zaman mesafesini göz önünde bulundurarak karşılaştırılması arzu edilir. Epileptik hayvanlarda video-EEG monitörizasyonu ile birlikte kombine BOS ve plazma örneklemesi, varsayılan tanısal ve prognostik biyobelirteçlerin doğrulanması için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, sürekli video-EEG izlenen epileptik sıçanlarda cisterna magna’dan kombine BOS çekilmesi ve lateral kuyruk veninden kan örneklemesi prosedürü anlatılmaktadır. Bu prosedür, yaygın olarak kullanılan diğer tekniklere göre önemli avantajlar sunar. Minimum ağrı veya invazivlik ve daha kısa anestezi süresi ile hızlı örneklemeye izin verir. Ek olarak, hem bağlı hem de telemetri EEG kayıtlı sıçanlarda BOS ve plazma örnekleri elde etmek için kullanılabilir ve birkaç günlük deney boyunca tekrar tekrar kullanılabilir. İzofluran anestezisini kısaltarak örneklemeden kaynaklanan stresi en aza indirerek, önlemlerin biyosıvılarda araştırılan moleküllerin gerçek seviyelerini daha doğru bir şekilde yansıtması beklenir. Uygun bir analitik testin mevcudiyetine bağlı olarak, bu teknik, aynı anda EEG kaydı yaparken birden fazla, farklı molekülün seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.
Introduction
Beyin omurilik sıvısı (BOS) ve kan örneklemesi, hem klinik öncesi hem de klinik araştırmalarda epilepsinin biyobelirteçlerini tanımlamak ve doğrulamak için önemlidir 1,2. Günümüzde epilepsi tanısı ve epilepsi biyobelirteçleri ile ilgili araştırmaların çoğu EEG ve nörogörüntüleme üzerine odaklanmaktadır 3,4,5. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar çeşitli sınırlamalar sunar. Rutin kafa derisi ölçümlerinin yanı sıra, çoğu durumda EEG, derinlik elektrotları gibi invaziv teknikler gerektirir6. Beyin görüntüleme yöntemleri zayıf zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahiptir ve nispeten pahalı ve zaman alıcıdır 7,8. Bu nedenle, non-invaziv, düşük maliyetli ve biyoakışkan bazlı biyobelirteçlerin tanımlanması çok çekici bir alternatif sağlayacaktır. Ek olarak, bu biyoakışkan biyobelirteçleri, öngörücülüklerini keskinleştirmek için mevcut tanısal yaklaşımlarla birleştirilebilir.
Epilepsi teşhisi konan hastalar rutin olarak EEG 9,10 ve kan örneklemesi 11,12,13,14’e ve birçoğu da hayatı tehdit eden nedenleri (yani akut enfeksiyonlar, otoimmün ensefalit) dışlamak için BOS yoksunluğuna gönderilir15. Bu kan ve BOS örnekleri, epilepsi için biyobelirteçleri tanımlamayı amaçlayan klinik araştırmalarda kullanılabilir. Örneğin, Hogg ve çalışma arkadaşları, insan epilepsisinde nöbet oluşumundan önce üç plazma tRNA fragmanındaki bir artışın olduğunu bulmuşlardır14. Benzer şekilde, insan BOS ve serumundaki interlökin-1beta (IL-1β) seviyeleri, BOS’taki IL-1β seviyelerinin seruma oranı olarak ifade edilir, travmatik beyin hasarı sonrası travma sonrası epilepsi gelişimini öngörebilir16. Bu çalışmalar, epilepsi biyobelirteçleri araştırmaları için biyoakışkan örneklemesinin önemini vurgulamaktadır, ancak klinik çalışmalara özgü birçok sınırlama ile karşı karşıyadırlar, örneğin, kandaki anti-epileptik ilaçların (AED’ler) kurucu faktörü, sık etiyoloji bilgisi eksikliği, yetersiz kontroller, mütevazı sayıda hasta ve diğerleri17,18.
Klinik öncesi araştırmalar, epilepsi için potansiyel biyobelirteçler olarak biyosıvılardaki molekülleri araştırmak için başka fırsatlar sunar. Aslında, EEG kayıtları yapılırken hayvanlardan plazma ve/veya BOS çekilmesi mümkündür. Ayrıca, örnekleme, deneyin birkaç günü boyunca tekrar tekrar gerçekleştirilebilir ve çalışmanın sağlamlığını artırmak için bir dizi yaş, cinsiyet ve epileptik hakaret uyumlu kontroller kullanılabilir. Burada, EEG ile izlenen sıçanlarda kuyruk veninden plazmanın paralel olarak çekilmesi ile cisterna magna’dan BOS elde etmek için esnek bir teknik ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sunulan tekniğin alternatif yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Kelebek iğne yaklaşımı kullanılarak, EEG elektrotlarının veya benzer kafa implantlarının işlevinden ödün vermeden BOS birkaç kez toplamak mümkündür. Bu, nispeten yüksek bir enfeksiyon riski ile ilişkili olan intratekal kateter geri çekme prosedürlerinin iyileştirilmesini temsil eder. Ek olarak, kan alma için kullanılan bildirilen serbest düşüş düşürme yaklaşımı, kanın tüpten geçmemesi ve vakum basıncı uygulanmaması nedeniyle hemoliz riskinin oldukça azalması nedeniyle diğer kuyruk veni kan alma yaklaşımlarından daha üstündür. Sıkı mikropsuz koşullar altında gerçekleştirilirse, hayvanlar için özellikle düşük bir enfeksiyon riski vardır. Ek olarak, hayvanların kuyruklarının en sonunda kan çekilmeleri başlatılarak, örnekleme birkaç kez tekrarlanabilir. Bu tür tekniklerin ustalaşması kolaydır ve merkezi sinir sistemi bozukluklarının birçok klinik öncesi çalışmasında uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, sadece epilepsi modellerinde değil, aynı zamanda Alzheimer, Parkinson veya multipl skleroz gibi diğer nörolojik durumlar veya hastalıklar için de yararlı olabilecek, sıçanlarda BOS ve kan toplama konusunda ustalaşması kolay bir tekniği göstermektedir. Epilepsi araştırmalarında, video-EEG ile birleştirilmiş her iki örnekleme prosedürü, farklı çözünür moleküllerin seviyeleri ile nöbet aktivitesi arasında bir korelasyon izlendiğinde idealdir. Bu özel nedenden dolayı, i) epileps…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Çalışma Programı’ndan (H2020-FETOPEN-2018-2020 çağrısı) 964712 hibe sözleşmesi (PRIME; M. Simonato’ya) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
Riferimenti
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
- Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
- van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
- Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
- Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
- Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
- Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
- Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
- Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
- Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
- Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis – diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
- Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
- Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
- Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
- Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
- Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- . Blood sampling: Rat Available from: https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022)
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
- Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
- Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
- Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
- Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
- Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy–comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
- van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
- Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).
