3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen
Summary
Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.
Abstract
Fototeerbare hydrogels kunnen ruimtelijk en tijdelijk transformeren als reactie op blootstelling aan licht. Door dit soort biomaterialen op te nemen in celkweekplatforms en dynamisch veranderingen teweeg te brengen, zoals toenemende stijfheid van het micro-milieu, kunnen onderzoekers veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) modelleren die optreden tijdens fibrotische ziekteprogressie. Hierin wordt een methode gepresenteerd voor het 3D-bioprinten van een fototunable hydrogel-biomateriaal dat in staat is tot twee opeenvolgende polymerisatiereacties in een gelatine-ondersteuningsbad. De techniek van Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting werd aangepast door de pH van het steunbad aan te passen om een Michael-additiereactie te vergemakkelijken. Eerst werd de bioink met poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) off-stoichiometrie gereageerd met een celafbreekbare crosslinker om zachte hydrogels te vormen. Deze zachte hydrogels werden later blootgesteld aan foto-initator en licht om de homopolymerisatie van niet-gereageerde groepen te induceren en de hydrogel te verstijven. Dit protocol omvat hydrogelsynthese, 3D-bioprinten, fotoverstijving en eindpuntkarakteriseringen om de activering van fibroblasten binnen 3D-structuren te beoordelen. De hier gepresenteerde methode stelt onderzoekers in staat om een verscheidenheid aan materialen te 3D-bioprinten die pH-gekatalyseerde polymerisatiereacties ondergaan en kunnen worden geïmplementeerd om verschillende modellen van weefselhomeostase, ziekte en herstel te ontwikkelen.
Introduction
3D-bioprinten is een transformatieve technologie die onderzoekers in staat stelt om cellen en biomaterialen nauwkeurig in 3D-volumes te deponeren en de complexe hiërarchische structuur van biologische weefsels na te bootsen. In het afgelopen decennium heeft de vooruitgang op het gebied van 3D-bioprinten geleid tot kloppend menselijk hartweefsel1, functionele modellen van nierweefsel2, modellen van gasuitwisseling in de long3 en tumormodellen voor kankeronderzoek4. De uitvinding van ingebedde 3D-bioprinttechnieken, zoals Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, heeft het mogelijk gemaakt om complexe structuren van zacht weefsel, zoals longbloedvaten5 en zelfs het menselijk hart6 , in 3D te reproduceren. FRESH 3D-bioprinten vergemakkelijkt het laag-voor-laag printen van zachte bio-inkten met een lage viscositeit door extrusie in een afschuifverdunnend ondersteunend bad. Het steunbad bestaat uit een materiaal zoals dicht opeengepakte gelatine-microdeeltjes die fungeren als een Bingham-plastic en na het printen de beoogde vorm en structuur van de bio-inkt behouden. Zodra de geprinte constructie is gestold, kan het steunbad worden opgelost door de temperatuur te verhogen tot 37 °C7.
Een recent overzichtsartikel gaf een overzicht van de materialen die in verschillende publicaties zijn 3D-bioprint met behulp van de FRESH-techniek. Deze natuurlijk afgeleide materialen variëren van collageen type I tot methacrylerend hyaluronzuur en vertegenwoordigen verschillende geleringsmechanismen7. De meeste onderzoeken die met deze 3D-bioprinttechniek worden uitgevoerd, maken gebruik van statische biomaterialen die niet veranderen als reactie op externe stimuli. Dynamische fototeerbare hydrogel-biomaterialen zijn door ons laboratoriumen anderen 8,9,10,11,12 gebruikt om een verscheidenheid aan fibrotische ziekten te modelleren. In tegenstelling tot statische biomaterialen, maken fototunable bioinks het mogelijk om een verzacht model met een lagere elasticiteitsmoduluswaarde te creëren en later te verstevigen om cellulaire reacties op toename van micro-omgevingsverstijving te onderzoeken.
Fibrotische ziekten worden gekenmerkt door een toename van de productie van extracellulaire matrix die littekens en verstijving kan veroorzaken13. Weefselverstijving kan leiden tot verder letsel en vernietiging van het aangetaste weefsel, met permanente orgaanschade en zelfs de dood tot gevolg; Fibrotische aandoeningen zijn verantwoordelijk voor een derde van de sterfte wereldwijd. Fibroblasten produceren overtollige en afwijkende extracellulaire matrix in deze ziektetoestand14,15. Verhoogde proliferatie van fibroblasten en afzetting van extracellulaire matrix verstijven het weefsel verder en activeren een profibrotische positieve feedbacklus16,17,18,19. Het bestuderen van fibroblastactivering is van vitaal belang voor het begrijpen van fibrotische ziekten. Hier presenteren we menselijke pulmonale arteriële hypertensie (PAH) als een voorbeeld van een fibrotische aandoening waarbij het belangrijk is om de 3D-geometrie van het bloedvat na te bootsen met behulp van 3D-bioprinten en de dynamische verstijvingsmogelijkheden van fototeerbare hydrogels te introduceren. PAH is een aandoening waarbij de druk in de hoofdlongslagaders het normale niveau overschrijdt en het hart belast, waardoor de activering van de adventitiële fibroblast van de menselijke longslagader (HPAAF) toeneemt en de bloedvatweefsels verstijft16,17,18,19. Een fototunable poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) bio-inktformulering zorgt voor temporele verstijving van constructen en helpt bij het modelleren van zowel gezond weefsel als ziekteprogressie 5,8,9,10. Door gebruik te maken van deze unieke eigenschap kan de activering en proliferatie van HPAAF worden gekwantificeerd als reactie op verstijving van micro-omgevingen in 3D en kan waardevol inzicht worden verkregen in de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij deze ziekte. Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om 3D-modellen te maken die veranderingen in de extracellulaire micro-omgeving tijdens ziekteprogressie of weefselherstel samenvatten en de activering van fibroblasten bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tweetraps polymerisatiereacties als reactie op gecontroleerde blootstelling aan licht kunnen biomaterialen verstijven met ruimtelijke en temporele controle. Verschillende studies hebben deze techniek gebruikt om cel-matrixinteracties in verschillende platforms te evalueren 5,8,9,10,11,21,22,23.</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) en degenen die de 3D Bioprinting Open-Source Workshop organiseerden, erkennen. Deze personen maakten het mogelijk om de technieken van FRESH bioprinting te leren en de 3D-bioprinter te bouwen die voor deze studies werd gebruikt. Daarnaast willen de auteurs Biorender.com erkennen, die in dit manuscript is gebruikt om cijfers te produceren. Dit werk werd ondersteund door meerdere groepen of financieringsbronnen, waaronder de Rose Community Foundation (DDH en CMM), een Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH en CMM), de National Science Foundation onder Award 1941401 (CMM), het Department of the Army onder Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), het National Cancer Institute van de NIH onder Award R21 CA252172 (CMM), het Ludeman Family Center for Women’s Health Research aan de Anschutz Medical Campus van de Universiteit van Colorado (DDH en CMM), het National Heart, Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health onder Awards R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) en T32 HL072738 (DDH en AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Riferimenti
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
