Summary
تم تطوير نموذج الماوس مؤشر عمل هرمون الغدة الدرقية لتمكين القياس الكمي الخاص بالأنسجة لعمل هرمون الغدة الدرقية المحلي باستخدام آليته التنظيمية الداخلية. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن النموذج مناسب لتوصيف المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء التي تتفاعل مع اقتصاد هرمون الغدة الدرقية ، سواء من خلال منهجيات خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي .
Abstract
تلعب هرمونات الغدة الدرقية (TH) دورا مهما في استقلاب الخلايا ووظيفة الأنسجة. اقتصاد TH عرضة للمواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs) التي يمكن أن تزعج إنتاج الهرمونات أو عملها. العديد من الملوثات البيئية هي EDCs ، مما يمثل تهديدا ناشئا لكل من صحة الإنسان والإنتاج الزراعي. وقد أدى ذلك إلى زيادة الطلب على أنظمة الاختبار المناسبة لدراسة آثار EDCs المحتملة. ومع ذلك، تواجه المنهجيات الحالية تحديات. تستخدم معظم أنظمة الاختبار علامات داخلية تنظمها عمليات تنظيمية متعددة ومعقدة في كثير من الأحيان ، مما يجعل من الصعب التمييز بين الآثار المباشرة وغير المباشرة. علاوة على ذلك ، تفتقر أنظمة الاختبار في المختبر إلى التعقيد الفسيولوجي لعملية التمثيل الغذائي EDC والحرائك الدوائية في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعرض ل EDCs البيئية عادة ما ينطوي على خليط من مركبات متعددة ، بما في ذلك المستقلبات المتولدة في الجسم الحي ، لذلك لا يمكن تجاهل إمكانية التفاعلات. هذا التعقيد يجعل توصيف EDC صعبا. فأر مؤشر عمل هرمون الغدة الدرقية (THAI) هو نموذج معدل وراثيا يحمل نظام مراسل لوسيفيراز مستجيب ل TH ، مما يتيح تقييم عمل TH الخاص بالأنسجة. يمكن للمرء تقييم التأثيرات الخاصة بالأنسجة للمواد الكيميائية على عمل TH المحلي عن طريق تحديد تعبير مراسل لوسيفيراز في عينات الأنسجة. علاوة على ذلك ، مع التصوير في الجسم الحي ، يسمح نموذج الماوس التايلاندي بإجراء دراسات طولية حول تأثيرات EDCs المحتملة في الحية. يوفر هذا النهج أداة قوية لاختبار التعرض طويل الأجل أو هياكل العلاج المعقدة أو الانسحاب ، لأنه يتيح تقييم التغييرات في عمل TH المحلي بمرور الوقت في نفس. يصف هذا التقرير عملية قياسات التصوير في الجسم الحي على الفئران التايلاندية. يركز البروتوكول الذي تمت مناقشته هنا على تطوير وتصوير الفئران المفرطة والغدة الدرقية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة عناصر تحكم. يمكن للباحثين تكييف أو توسيع العلاجات المقدمة لتلبية احتياجاتهم الخاصة ، وتقديم نهج أساسي لمزيد من التحقيق.
Introduction
إشارات هرمون الغدة الدرقية (TH) هي منظم أساسي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، وهي ضرورية للتطور الطبيعي ووظيفة الأنسجة المثلى في مرحلة البلوغ1. داخل الأنسجة ، يتم التحكم في عمل TH بدقة بواسطة آلية جزيئية معقدة ، مما يسمح بصيانة الأنسجة الخاصة بمستويات TH المحلية. هذا الاستقلال الذاتي للأنسجة المختلفة من مستويات TH المتداولة له أهمية كبيرة2،3،4.
العديد من المواد الكيميائية لديها القدرة على تعطيل وظائف الغدد الصماء وتوجد في البيئة كملوثات. إنه قلق متزايد من أن هذه الجزيئات يمكن أن تدخل السلسلة الغذائية من خلال مياه الصرف الصحي والإنتاج الزراعي ، مما يؤثر على صحة الماشية والبشر5،6،7.
أحد التحديات الكبيرة في معالجة هذه المشكلة هو العدد الهائل من المركبات المعنية ، بما في ذلك الجزيئات المصرح بها والمحظورة بالفعل ، ولكنها لا تزال موجودة باستمرار. في السنوات الأخيرة ، بذلت جهود كبيرة لتطوير أنظمة اختبار لفحص وتحديد الإمكانات التخريبية لمختلف المواد الكيميائية8،9،10،11. في حين أن هذه الأساليب تتفوق في الفحص عالي الإنتاجية لآلاف المركبات وتحديد التهديدات المحتملة ، فإن التحليل التفصيلي للتأثيرات المحددة في الجسم الحي لهذه الجزيئات ضروري لتحديد مخاطر التعرض البشري. وبالتالي ، من الضروري اتباع نهج متعدد الأوجه عند دراسة وتوصيف المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs).
في سياق تنظيم TH ، يتطلب فهم العواقب الخاصة بالأنسجة للتعرض ل EDC تحديد كمية عمل TH المحلي. على الرغم من تطوير العديد من النماذج في الجسم الحي لهذا الغرض ، إلا أن معظمها يعتمد على العلامات الداخلية كمقياس للإنتاج. على الرغم من كونها فسيولوجية ، إلا أن هذه العلامات تخضع للعديد من الآليات التنظيمية ، المباشرة وغير المباشرة ، مما يجعل تفسيرها أكثر صعوبة. لذلك ، لا يزال توصيف تأثيرات EDC على تنظيم TH على مستوى الأنسجة يمثل تحديا كبيرا12،13.
لمواجهة تحديات قياس إشارات TH الخاصة بالأنسجة ، تم تطوير نموذج الماوس لمؤشر عمل هرمون الغدة الدرقية (THAI) مؤخرا. يسمح هذا النموذج بتقدير كمي محدد للتغيرات في عمل TH المحلي في ظل الظروف الداخلية. تم إدخال جين تحوير لوسيفيراز في جينوم الفأر ، وهو حساس للغاية للتنظيم من خلال الإجراءTH 14. أثبت هذا النموذج فعاليته في الإجابة على أسئلة البحث المختلفة التي تتطلب تحديد التغيرات في الأنسجة المحلية TH التي تشيرإلى 14،15،16،17،18.
إن التعرف على أحد الاستخدامات المحتملة للنموذج التايلاندي هو توصيف التأثيرات الخاصة بالأنسجة ل EDCs على إشارات TH. وقد استخدم النموذج مؤخرا بنجاح لاستقصاء التأثيرات الخاصة بالأنسجة لرباعي البروم ثنائي الفينول ألف وديكلازوريل على إشارات TH15. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات خط الأساس لاستخدام تقنيات التصوير في الجسم الحي على النموذج التايلاندي كنظام اختبار لتوصيف EDCs التي تعطل وظيفة TH. تستفيد هذه الطريقة من الطبيعة الحيوية لتفاعل لوسيفيرين-لوسيفيراز. بشكل أساسي ، يحفز إنزيم اللوسيفيراز المعبر عنه وراثيا أكسدة اللوسيفرين المعطى ، مما يولد ضوءا مضيئا يتناسب مع كمية اللوسيفيراز في الأنسجة (الشكل 1). وبالتالي ، فإن الاستجابة البيولوجية المقاسة هي نشاط لوسيفيراز ، والذي تم التحقق من صحته كمقياس مناسب لعمل TH المحلي14. في حين أن نموذج THAI قابل للتطبيق لقياس عمل TH في جميع الأنسجة تقريبا ، يركز التصوير في الجسم الحي بشكل أساسي على عمل TH في الأمعاء الدقيقة (التصوير البطني) والأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين (BAT ، التصوير الظهري)14.
من المزايا المهمة لتقنية التصوير في الجسم الحي أنها تلغي الحاجة إلى التضحية بالحيوانات من أجل القياسات. وهذا يسمح للباحثين بتصميم تجارب طولية ومتابعة كدراسات ذاتية التحكم ، مما يقلل من التحيز بين الموضوعات وعدد المستخدمة. هذا الجانب مهم بشكل خاص في توصيف EDC ، وقد تم إثبات قوة الطريقة وتعدد استخداماتها لهذا الغرض سابقا14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة هذا البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة رعاية في معهد الطب التجريبي (PE / EA / 1490-7 / 2017 ، PE / EA / 106-2 / 2021). البيانات المقدمة مأخوذة من خلفية FVB / Ant14 ، ذكور الفئران التايلاندية البالغة من العمر 3 أشهر (ن = 3-6 / مجموعة). خلفية FVB / النمل تميل التايلاندية إلى وجود بقع شديدة التصبغ على جلدها قد تشوه القياسات. ومن ثم ، ابحث عن البقع المصطبغة على جلد المنطقة المصورة بعد إزالة الفراء. لا تتطلب ظروف سكن خاصة ما لم تتطلب التجربة ذلك على وجه التحديد (على سبيل المثال ، نظام غذائي خاص).
1. علاج فرط نشاط الغدة الدرقية
ملاحظة: يتم توفير بروتوكول عام لتحفيز فرط نشاط الغدة الدرقية في الفئران هنا. يقدم دليل ATA19 تفسيرات مفصلة حول خلفية الطرق مع البدائل المذكورة.
- قم بإذابة T3 (3،5،3'-ثلاثي يودوثيرونين ، انظر جدول المواد) في 40 mM NaOH لإنشاء محلول مخزون بتركيز يتراوح بين 5-10 مجم / مل.
- قم بتخفيف محلول المرق بالمحلول الملحي إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر.
- حقن محلول T3 المخفف داخل الصفاق (i.p.) في المستيقظة بحجم 10 ميكرولتر لكل جرام من وزن الجسم (bwg). بعد 24 ساعة ، سيتم اعتبار فرط نشاط الغدة الدرقية.
ملاحظة: يمكن استبدال علاج T3 بأي نوع آخر من العلاج. لا يؤثر العلاج على بروتوكول التصوير في الجسم الحي .
2. علاج الغدة الدرقية
ملاحظة: هنا ، يتم توفير بروتوكول عام فقط للحث على قصور الغدة الدرقية في الفئران. يصف دليل ATA19 تفسيرات مفصلة على خلفية الطرق مع البدائل المذكورة.
- قم بتبديل النظام الغذائي إلى نظام غذائي خال من اليود وأضف KClO4 و methimazole إلى مياه الشرب (0.01٪ ميثيمازول ، 0.05٪ KClO4) (انظر جدول المواد).
- استبدل محلول الشرب بانتظام (كل 2-3 أيام) بمحلول شرب طازج لأن الميثيمازول حساس للضوء ويتحلل بسرعة.
- الحفاظ على نظام العلاج لمدة 2 أسابيع على الأقل ، لا يزيد عن 4 أسابيع. سوف تفقد الوزن وسوف تظهر عدم الراحة. إذا كانت بالكاد تتحرك ، أو فقدت الكثير من شعرها ، أو بالكاد كانت واعية ، فاستخدم نقطة نهاية إنسانية وقم بإنهائها بأي طريقة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
- استمر في علاج قصور الغدة الدرقية عندما يقترن بعلاجات أخرى لمنع الشفاء المحتمل من قصور الغدة الدرقية.
3. التصوير في الجسم الحي
- ابدأ تشغيل البرنامج المتوافق مع نظام التصوير في الجسم الحي (انظر جدول المواد).
- قم بتسجيل الدخول وانتظر حتى يتم تحميل لوحة "معالج التصوير". إنها لوحة أصغر في أسفل يسار النافذة.
- في "معالج التصوير" ، ابدأ تبريد الكاميرا بالنقر فوق تهيئة في "لوحة معالج الصور". هذا يجعل الأداة تعمل على تشغيل بروتوكول إعداد ، انتظر حتى يكتمل. تتحول "لوحة معالج التصوير" إلى اللون الأزرق ، وسيتم تشغيل ضوء أخضر في اللوحة عندما تكون درجة حرارة الكاميرا منخفضة بدرجة كافية والجهاز جاهز.
- اضبط درجة حرارة وسادة التدفئة على 30-37 درجة مئوية للحفاظ على دفء المقاسة.
ملاحظة: استمر في البروتوكول أثناء انتظار أن تكون درجة حرارة الكاميرا مثالية. - لا تبقي أو تعامل بالقرب من الجهاز. تجنب الكميات الزائدة من الشعر المنتشر في الهواء حول الجهاز.
- تخدير 1-3 بحقن الكيتامين - زيلازين (الكيتامين 50 ملغم/كغ من وزن الجسم، الزيلازين 10 ملغم/كغم من وزن الجسم، انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، إذا تم تركيب نظام تخدير إيزوفلوران ، فاتبع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا لاستخدام تخدير الأيزوفلوران ، لتحل محل خليط الكيتامين - الزيلازين.
ملاحظة: الفئران الغدة الدرقية هي أكثر حساسية للكيتامين زيلازين. استخدم نصف جرعة. - استخدم جل حماية العين أثناء التخدير.
- تحقق من منعكس الدواسة عن طريق الضغط على وسادات القدم. لا يوجد منعكس دواسة يؤكد حالة التخدير الجراحي للطائرة.
- بعد سريان مفعول التخدير ، قم بإزالة الفراء من أجزاء الجسم المصورة باستخدام أنسب طريقة لإزالة الفراء (آلة إزالة الشعر ، الحلاقة ، الكريم ، إلخ). تأكد من عدم ترك الفراء على أجزاء الجسم المصورة لمنع تشتت الضوء المضيء.
- قم بإذابة Na-luciferin (انظر جدول المواد) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بتركيز 15 مجم / مل. لوسيفيرين حساس للضوء. تجنب التعرض المباشر للضوء. قم بتخزين المحلول في أنابيب كهرمانية أو لفه بورق الألمنيوم.
- عالج الحليقة بمحلول لوسيفيرين 10 ميكرولتر / وزن الجسم i.p.
- ضع في الجهاز مع وضع علامة "+" على نقطة مركز الكاميرا على اللوحة. تأكد من الموضع المناسب عن طريق التحقق من خطوط الشبكة والتأكيد بالتقاط "صورة" واحدة إذا لم تكن متأكدا.
- انتظر لمدة 15 دقيقة بعد إعطاء الركيزة قبل أخذ القياس الأول. خلال هذا الوقت ، اضبط وقت التصوير في لوحة "معالج الصور" على 3 دقائق للتلألؤ وحدد مربعات الصور والتألق. "الصورة" ضرورية لتتزامن مع التلألؤ لتحديد مصدر الإشارة المقاسة.
ملاحظة: مطلوب 15 دقيقة لامتصاص الركيزة الأمثل وتوزيع الأنسجة. هضبة إشارة الإنارة 15-20 دقيقة بعد إعطاء لوسيفيرين. تبدأ الإشارة في الانخفاض ببطء بعد الهضبة. - خذ القياس الأول بالنقر فوق قياس في لوحة "معالج التصوير".
- إذا تم إجراء كل من التصوير البطني والظهري ، فأعد ترتيب للجزء الثاني من الجسم ليتم تصويره فور الانتهاء من الجزء الأول.
- بعد الانتهاء من التصوير ، أعد إلى أقفاصها واستمر في التجربة مع المجموعة التالية من.
- اسمح للحيوانات بالتعافي ، والتي تستغرق عادة 1-2 ساعة على الأكثر. ضع أنبوبا مملوءا بالماء الدافئ بالقرب من لتسهيل الشفاء ، ومراقبة العلامات الحيوية مثل التنفس والتروية.
- تقرر مصير المقاسة. في البيانات المقدمة في هذه المقالة ، تم القتل الرحيم للحيوانات المقاسة وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا للقياسات خارج الجسم الحي . ومع ذلك ، هذا ليس ضروريا. فكر فيما إذا كان القتل الرحيم أو تجارب المتابعة أخلاقية.
4. تحليل البيانات
- افتح ملف "ClickInfo" في البرنامج. سيتم فتح لوحة باسم "لوحة الأدوات" لتحليل الصور وتحريرها على الجانب الأيمن من النافذة.
- تحويل المقياس إلى إشعاع في الزاوية العلوية اليسرى من الصورة.
- انقر فوق "ضبط الصورة".
- حدد التجميع الأمثل ومقياس الألوان للصور. اجعل جميع الصور تستخدم نفس الإعدادات.
- انقر فوق "أدوات عائد الاستثمار" في "لوحة الأدوات".
- حدد مجالات الاهتمام بالنقر فوق "وضع عائد الاستثمار" في "أدوات عائد الاستثمار". يمكن أن يكون استخدام نفس حجم عائد الاستثمار أو عائد استثمار مختلف الحجم مفيدا أيضا اعتمادا على التصميم التجريبي.
- انقر فوق "قياس عائد الاستثمار". سيتم فتح نافذة جديدة تحتوي على بيانات عائد الاستثمار الموضوع. قم بتصدير البيانات باستخدام الأمر ctr + c-ctrl + v Windows إلى برنامج تنظيمي أو إحصائي من اختيارك.
- يمكن تصدير البيانات كتدفق كلي أو إشعاع متوسط. اختر المتغير الأكثر صلة في الإعداد التجريبي الحالي.
- مواصلة تحليل البيانات وفقا للتصميم التجريبي. يوصى بالحساب الفردي لقيم (الخلفية المعالجة) على أنها "تأثير مقاس في واحد".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بشكل عام ، يتراوح الإشعاع المقاس من مقادير 105 إلى 1010 p / s/ cm 2 / sr. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف القيم الدقيقة بين داخل نفس الصورة وعبر الصور المختلفة. لذلك ، قد تكون مقارنة البيانات الأولية مضللة. من الضروري إنشاء إشارات تحكم وخلفية في جميع التجارب ، مما يجعل التصميمات ذاتية التحكم موصى بها للغاية.
يقدم الشكل 2 صورا وبيانات تمثيلية من المناظر البطنية والظهرية في إعداد تجريبي يشمل الفئران التي تعاني من نقص السكر في الدم و eu وفرط نشاط الغدة الدرقية. من المتوقع أن تكون أدنى الإشارات في الفئران قصور الغدة الدرقية ، وغالبا ما تنخفض إلى ما دون الحد الأدنى لمقياس الألوان.
تظهر المناطق التي تفتقر إلى الفراء ، مثل وسادات القدم والذيل والأنف ، إشارات قاعدية عالية نسبيا. الأهم من ذلك ، تتأثر إشارة لوسيفيراز بحالة هرمون الغدة الدرقية (TH) ، كما هو موضح في الشكل 2. ومن المثير للاهتمام ، يوضح الشكل 3 أن عمل TH يزداد بشكل ملحوظ في الأنسجة الدهنية البنية (BAT) للفئران التايلاندية المجهدةعلى البارد 14. ومع ذلك ، لا يؤثر هذا العلاج على إشارة لوسيفيراز في وسادات القدم والذيل. يؤكد هذا التباين على إمكانية حدوث إجراءات TH متميزة بشكل ملحوظ في أنسجة نفس الكائن الحي. يؤدي التعرض البارد إلى تنشيط BAT ، مما يستلزم تنظيما موضعيا لتنشيط TH بوساطة الديوديناز من النوع 220,21. بعد 24 ساعة من التعرض للبرد ، تظل مستويات TH المنتشرة دون تغيير ، مما يؤدي إلى عدم تغيير الإشارة المعتمدة على TH في وسادات القدم والذيل. في المقابل ، في السيناريو الموضح في الشكل 2 ، حيث تؤدي مستويات TH المرتفعة في الدم إلى زيادة عمل TH في وسادة القدم والذيل و BAT.
يكشف كل من الشكل 2 والشكل 3 عن إشارات قوية في منطقة الخصية. ويعزى ذلك إلى التعبير القاعدي العالي المستقل عن TH لجين التحوير luciferase في الخصيتين ، وهي سمة من سمات النموذج التايلاندي. في هذا العضو ، تظل إشارة لوسيفيراز غير متأثرة بالتغيرات في مستويات TH المتداولة.
كما ذكرنا سابقا ، يمكن استبدال علاجات قصور الغدة الدرقية وفرط نشاط الغدة الدرقية بتدخلات أخرى ، مثل اختبار المركبات المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs). يعرض الشكل 4 تصوير BAT في تجربة متابعة مدتها ثلاثة أسابيع تتضمن ديكلازوريل ، وهو دواء بيطري مع إمكانات EDC16. يمكن تمييز الإشارات بين النقاط الزمنية بسهولة ، وتلتقط الطريقة بشكل فعال تراكم وإزالة diclazuril.
الشكل 1: مفهوم ومبادئ عمل البناء التايلاندي. (أ) البناء التايلاندي المؤتلف. هذا الرقم مقتبس من Mohácsik et al.14. (ب) رسم تخطيطي لأكسدة لوسيفيرين المحفزة بالإنزيم اللوسيفيرازي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور ظهرية وبطنية تمثيلية للفئران التايلاندية التي تعاني من نقص الغدة الدرقية والاتحاد الأوروبي وفرط نشاط الغدة الدرقية، إلى جانب مخطط شدة نشاط لوسيفيراز. (أ) صور تمثيلية للفئران التايلاندية التي تعاني من نقص السكر والبحر الأوروبي وفرط نشاط الغدة الدرقية. (ب) القياس الكمي للإشارات في (أ). متوسط الفوتون / ثانية ± SEM (ن = 3). *P < 0.05; P < 0.001 ، يحدده ANOVA أحادي الاتجاه ، يليه اختبار Newman-Keuls اللاحق. هذا الرقم مقتبس من Mohácsik et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إشارات المخلب والذيل و BAT قبل وبعد الإجهاد البارد ، جنبا إلى جنب مع مخطط شدة الضوء لنشاط لوسيفيراز. (أ) صور ظهرية تمثيلية للفئران الضابطة والفئران التايلاندية المجهدة على البرد. (ب) القياس الكمي للإشارات في (أ). متوسط الفوتون / ثانية ± SEM (ن = 4). ** P < 0.001 ، يحدده اختبار t للطالب. هذا الرقم مقتبس من Mohácsik et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور BAT التمثيلية لدراسة متابعة ديكلازوريل لمدة ثلاثة أسابيع ، مصحوبة بمخطط شدة الضوء لنشاط لوسيفيراز. عولجت الفئران التايلاندية عن طريق الفم لمدة 2 أسابيع مع 10 ملغ / وزن الجسم / يوم من ديكلازوريل كمعلق ملحي ، تليها أسبوع واحد من الشفاء. (أ) القياس الكمي لإشارات التوهج الحيوي BAT في (B) قبل وأثناء وبعد معالجة الديكلازوريل. (ب) صور ظهرية تمثيلية للفئران التايلاندية قبل وأثناء وبعد العلاج بالديكلازوريل. ن = 4-6 فئران / مجموعة ؛ يعرض الشكل مخطط Tukey Box للفوتون / ثانية ، α = 0.05 ؛ ص < 0.001.: هذا الرقم مقتبس من Sinko et al.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن التهديدات التي تشكلها المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs) على صحة الإنسان معترف بها جيدا. ومع ذلك ، فإن البحث في EDCs يواجه تحديات هائلة. هذه التحديات هي جزئيا نتيجة لتعقيد نظام الغدد الصماء. تم تحديد العديد من EDCs لتعطيل أنظمة الغدد الصماء المتعددة في وقتواحد 22. بالإضافة إلى ذلك ، في سياق اقتصاد هرمون الغدة الدرقية (TH) ، توجد طبقة إضافية من التعقيد بسبب الاختلافات الخاصة بالأنسجة في تنظيم عمل TH. يوفر هذا التعقيد منظورا جديدا لتوسيع تقييم إشارات TH من خلال توصيف عمل TH في الأنسجة المختلفة. يتفاقم التحدي بسبب استقلاب المركبات ، والتي يمكن أن تعزز أو تخفف من آثارها على نظام الغدد الصماء. من المهم ملاحظة أن طرق الفحص الحالية لتحديد المركبات راسخة وتعمل بأداءعال 8,11. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في أنظمة الاختبار لتوصيف الآثار والعواقب الخاصة بالأنسجة للمركبات المحددة.
تم تطوير نموذج الفأر التايلاندي لمواجهة تحديات توصيف اقتصاد هرمون الغدة الدرقية الخاص بالأنسجة. وقد أثبتت إمكاناتها في ظل ظروف مختلفة14،15،16،18. يوفر النموذج التايلاندي ميزة في توصيف المواد الكيميائية التي تعطل هرمونات الغدة الدرقية. من المهم ملاحظة أن النموذج ليس مخصصا للفحص المركب السريع ، ولكن لتقديم رؤى حول آليات الاضطراب في نموذج الثدييات في الجسم الحي .
في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول يوضح كيف يمكن استخدام الماوس التايلاندي في دراسات التصوير في الجسم الحي . تسمح هذه الطريقة باختبار العلاجات التي تؤثر على محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدة الدرقية (HPT) و / أو عمل هرمون الغدة الدرقية في. يدعم البروتوكول الدراسات ذاتية التحكم وتصميمات المتابعة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لتوليد مراقبة مع حالات هرمون الغدة الدرقية المختلفة ، والتي تعمل كمراجع في البيئات التجريبية. يمكن استبدال علاجات قصور الغدة الدرقية وفرط نشاط الغدة الدرقية المقدمة وتوسيعها ودمجها مع علاجات أخرى حسب الحاجة. هذا التنوع ذو قيمة لتقييم اقتصاد هرمون الغدة الدرقية في الأنسجة ، خاصة بالنسبة للتوصيف الكيميائي الذي يعطل الغدد الصماء (EDC).
تأتي إشارات التصوير في الجسم الحي على الجانب الظهري من الأنسجة الدهنية البنية (BAT) ، بينما تنشأ الإشارات البطنية من الأمعاء الدقيقة14. وبالتالي ، فإن الطريقة تميز هذه الأنسجة في المقام الأول ، وقد يكون قياس أجزاء الجسم الأخرى أمرا صعبا. يتطلب التغلب على هذه القيود التقنية من خلال التعرض للأعضاء دراسة متأنية للآثار الأخلاقية والتقنية.
يسمح الجمع بين التصوير في الجسم الحي والدراسات خارج الجسم الحي على نموذج THAI بتقييم إشارات هرمون الغدة الدرقية في مختلف الأنسجة ومناطق الدماغ14. على سبيل المثال ، يمكن ل qPCR توسيع وتحديد التأثيرات التي تظهر في التصوير في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن هذا يضحي بالمتابعة والتصاميم ذاتية التحكم ، لذلك يجب تقييم التكاليف والفوائد. يوصى بالجمع بين التصوير في الجسم الحي والقياسات خارج الجسم الحي لإجراء تحقيق شامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المشروع رقم. تم تنفيذ RRF-2.3.1-21-2022-00011 ، بعنوان المختبر الوطني لعلم الأعصاب الانتقالي بدعم من مرفق التعافي والقدرة على الصمود التابع للاتحاد الأوروبي في إطار برنامج Széchenyi Plan Plus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,5,3'-triiodothyronine (T3) | Merck | T2877 | |
| Animals, mice | THAI mouse | ||
| Eye protection gel | Oculotect | 1000 IU/g | |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | 50 mL volume | |
| Iodine-free chow diet | Research Diets | custom | |
| IVIS Lumina II in vivo imaging system | Perkin Elmer | - | |
| Ketamine | Vetcentre | E1857 | |
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer | - | provided with the instrument |
| Measuring cylinder | 250 mL | ||
| methimazole | Merck | M8506 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | For diluting treatment materials | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferin, substrate | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Phoshphate buffer saline | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipette | Gilson | For diluting treatment materials | |
| Pipette tips | Axygen | For diluting treatment materials | |
| Shaving cream/epilator/shaver | Personal preference | ||
| Syringe | B Braun | 1 mL volume | |
| Syringe needle | B Braun | 0.3 x 12 mm | |
| Xylazine | Vetcentre | E1852 |
References
- Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D. Williams Textbook of Endocrinology. Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. , W.B. Saunders Co. 389-515 (1998).
- Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
- Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
- Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
- Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
- Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710 (2022).
- La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
- Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
- Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
- Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249 (2021).
- Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
- Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798 (2022).
- Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
- Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
- Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782 (2022).
- Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
- Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683 (2023).
- Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394 (2022).
- Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
- Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
- Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244 (2022).
