Pseudotypade virus som ett molekylärt verktyg för att övervaka humana immunsvar mot SARS-CoV-2 via neutralisationsanalys
Summary
Pseudotypade virus (PV) är replikationsdefekta virioner som används för att studera värd-virusinteraktioner under säkrare förhållanden än vid hantering av autentiska virus. Här presenteras ett detaljerat protokoll som visar hur SARS-CoV-2 PV kan användas för att testa den neutraliserande förmågan hos patienters serum efter COVID-19-vaccination.
Abstract
Pseudotypade virus (PV) är molekylära verktyg som kan användas för att studera värd-virusinteraktioner och för att testa den neutraliserande förmågan hos serumprover, förutom deras mer kända användning i genterapi för leverans av en gen av intresse. PV är replikationsdefekt eftersom virusgenomet är uppdelat i olika plasmider som inte är inkorporerade i PV:erna. Detta säkra och mångsidiga system gör det möjligt att använda solceller i laboratorier med biosäkerhetsnivå 2. Här presenterar vi en generell metod för att producera lentivirala PV baserade på tre plasmider som nämns här: (1) ryggradsplasmiden som bär reportergenen som behövs för att övervaka infektionen; 2. Förpackningsplasmiden som bär generna för alla strukturella proteiner som behövs för att generera PV. (3) Höljets ytglykoproteinuttrycksplasmid som bestämmer virusets tropism och förmedlar virusets inträde i värdcellen. I detta arbete är SARS-CoV-2 Spike det höljeglykoprotein som används för produktion av icke-replikativa SARS-CoV-2 pseudotypade lentivirus.
I korthet samtransfekterades förpackningsceller (HEK293T) med de tre olika plasmiderna med hjälp av standardmetoder. Efter 48 timmar skördades, filtrerades supernatanten som innehöll PV och förvarades vid -80 °C. Infektiviteten hos SARS-CoV-2 PV testades genom att studera uttrycket av reportergenen (luciferas) i en målcellinje 48 timmar efter infektion. Ju högre värde för relativa luminiscensenheter (RLU), desto högre infektions-/transduktionshastighet. Dessutom tillsattes de infektiösa PV:erna till de serieutspädda serumproverna för att studera neutraliseringsprocessen av pseudovirus inträde i målceller, mätt som minskningen av RLU-intensiteten: lägre värden motsvarande hög neutraliserande aktivitet.
Introduction
Pseudotypade virus (PV) är molekylära verktyg som används inom mikrobiologi för att studera värd-virus och patogen-patogeninteraktioner 1,2,3,4. PV består av en inre del, den virala kärnan som skyddar virusgenomet, och en yttre del, höljeglykoproteinerna på ytan av viruset som definierar tropismen5. Ett pseudovirus är replikationsinkompetent i målcellen eftersom det inte innehåller all genetisk information för att generera nya viruspartiklar. Denna kombination av märkliga egenskaper gör PV till ett säkert alternativ till ett vildtypsvirus. Wildtype-virus, å andra sidan, är högpatogena och kan inte användas i BSL 2-laboratorier för analys6.
Infektiviteten hos PV kan övervakas av en reportergen, som vanligtvis kodar för ett fluorescerande protein (GFP, RFP, YFP) eller ett enzym som producerar kemiluminescerande produkter (luciferas). Detta finns i en av de plasmider som används för PV-produktion och ingår i genomet hos pseudovirus7.
Det finns för närvarande flera typer av PV-kärnor, inklusive lentivirala partiklar baserade på HIV-1-genomet. Den stora fördelen med HIV-1-baserade PV jämfört med andra plattformar är deras inneboende integrationsprocess i målcellens genom. Även om HIV-1 är ett mycket smittsamt virus och orsakar AIDS, är dessa lentivirala vektorer säkra att använda på grund av de omfattande optimeringsstegen under åren. Optimala säkerhetsförhållanden uppnåddes med introduktionen av 2:a generationens lentivirala vektorer, där virala gener utarmades utan att påverka transduktionsförmågan9. Den 3:e och 4:e generationen bidrog till den ökade säkerheten för hantering av lentivirala vektorer genom ytterligare uppdelning av virusgenomet i separata plasmider10,11. De senaste generationerna av PV används i allmänhet för att producera lentivirala vektorer för genterapi.
PV kan användas för att studera interaktioner mellan virus och värdceller, både under produktions- och infektionsfasen. PV används särskilt i pseudovirusneutralisationsanalyser (PVNA). PVNA valideras i stor utsträckning för att bedöma neutraliseringspotentialen hos serum eller plasma genom att rikta in sig på det virala glykoproteinet på PV:s hölje12,13. Neutralisationsaktivitet, uttryckt som den hämmande koncentrationen 50 (IC50), definieras som den utspädning av serum/plasma som blockerar 50 % av viruspartikelposten14. I detta protokoll beskrev vi upplägget av en PVNA för att testa antikroppsaktiviteten mot Severe Acute Respiratory Syndrome – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i serum som samlats in före och efter att ha fått en boostervaccindos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om användning av ett vildtypsvirus simulerar den faktiska infektionen, är lentivirala PV ett säkrare alternativ för att studera mekanismerna i samband med virusinträde och infektion utan de strikta säkerhetskrav som krävs för att arbeta med patogena virus 4,20,21. PV består av en replikationsdefekt viruskärna omgiven av ythöljets glykoprotein från ett patogent virus, vilket är syftet med studien.
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka sjukvårdspersonalens volontärer för deras bidrag. Detta projekt stöddes av Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien. AR och DZ fick stöd av PRIN2022 (EU-finansiering; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Riferimenti
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
