Bu protokol, EV’nin pıhtılaşma yeteneğinin bir göstergesi olarak hücre dışı vezikülden (EV) zengin plazmanın kullanımını araştırır. EV’den zengin plazma, diferansiyel santrifüjleme ve ardından yeniden kalsifikasyon işlemi ile elde edilir.
Hücre dışı veziküllerin (EV) çeşitli hastalıklardaki rolü, özellikle güçlü prokoagülan aktiviteleri nedeniyle artan bir ilgi görmektedir. Bununla birlikte, klinik ortamlarda EV’nin prokoagülan aktivitesini değerlendirmek için acil bir yatak başı testine ihtiyaç vardır. Bu çalışma, EV’nin prokoagülan aktivitesinin bir ölçüsü olarak EV’den zengin plazmanın trombin aktivasyon zamanının kullanılmasını önermektedir. Sodyum sitratlı tam kan elde etmek için standartlaştırılmış prosedürler kullanıldı, ardından EV’den zengin plazma elde etmek için diferansiyel santrifüjleme yapıldı. EV bakımından zengin plazma ve kalsiyum klorür test kabına eklendi ve viskoelastisitedeki değişiklikler bir analizör kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. EV-ACT olarak adlandırılan EV’den zengin plazmanın doğal pıhtılaşma süresi belirlendi. Sonuçlar, sağlıklı gönüllülerden elde edilen plazmadan EV çıkarıldığında EV-ACT’de önemli bir artış olduğunu ortaya koyarken, EV zenginleştirildiğinde önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. Ayrıca, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanserinden alınan insan örneklerinde EV-ACT önemli ölçüde kısaldı, bu da plazma EV seviyelerinin yükseldiğini ve kan hiperkoagülasyonunun desteklendiğini gösterdi. Basit ve hızlı prosedürü ile EV-ACT, yüksek plazma EV düzeyleri olan hastalarda pıhtılaşma fonksiyonunu değerlendirmek için bir yatak başı testi olarak umut vaat etmektedir.
Hiper pıhtılaşmanın neden olduğu tromboz, beyin travması1, preeklampsi2, tümörler3 ve kırık hastaları4 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynar. Hiper pıhtılaşmanın altında yatan mekanizma karmaşıktır ve son zamanlarda pıhtılaşma bozukluklarında hücre dışı veziküllerin (EV) rolüne vurgu yapılmıştır. EV’ler, çapı 10 nm ila 1000 nm arasında değişen, hücre zarından ayrılan iki katmanlı bir yapıya sahip vezikül benzeri cisimlerdir. Başta pıhtılaşma bozuklukları olmak üzere çeşitli hastalık süreçleriyle ilişkilidirler5. Birkaç çalışma, EV’leri tromboz riskinin umut verici bir belirleyicisi olarak tanımlamıştır 6,7. EV’lerin prokoagülan aktivitesi, başta doku faktörü (TF) ve fosfatidilserin (PS) olmak üzere pıhtılaşma faktörlerinin ekspresyonuna bağlıdır. Güçlü prokoagülan aktiviteye sahip EV’ler, tenaz ve protrombin kompleksinin katalitik etkinliğini önemli ölçüde arttırır, böylece trombin aracılı fibrinojen ve lokal trombozuteşvik eder 8. Çok sayıda hastalıkta yüksek EV seviyeleri ve bunların hiper pıhtılaşma ile nedensel ilişkisi gözlenmiştir9. Sonuç olarak, EV’lerin tespitinin standartlaştırılması ve prokoagülan aktivitelerinin raporlanması önemli bir araştırma alanıdır10.
Bugüne kadar, EV’lerin prokoagülan aktivitesini tespit etmek için sadece birkaç ticari kit mevcuttur. Ticari bir şirket tarafından üretilen MP-Aktivite testi ve MP-TF testi, EV’nin plazma11’deki prokoagülan aktivitesini ölçmek için kullanılan fonksiyonel testlerdir. Bu testler, EV’lerde PS ve TF’yi tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testlerine benzer bir prensip kullanır. Bununla birlikte, bu kitler pahalıdır ve birkaç üst düzey araştırma kurumuyla sınırlıdır. Süreç karmaşık ve zaman alıcıdır, bu da bunları klinik ortamlarda uygulamayı zorlaştırır. Ek olarak, ticari olarak geliştirilmiş bir prokoagülan fosfolipid (PPL) testi, PS pozitif EV’lerin12 seviyelerini kantitatif olarak tespit etmek için pıhtılaşma süresini ölçerek, PS içermeyen plazmayı test plazması ile karıştırır. Bununla birlikte, bu tahliller öncelikle EV’lerde PS ve TF’ye odaklanır ve dolaşımdaki EV’lerin12’de yer alabileceği diğer pıhtılaşma yollarını gözden kaçırır.
Plazma pıhtılaşma sistemi karmaşıktır ve pıhtılaştırıcılar, antikoagülanlar, fibrinolitik sistemler ve plazmada asılı EV’ler dahil olmak üzere hem “görünmez” hem de “görünür” bileşenleri içerir. Fizyolojik olarak, bu bileşenler dinamik bir denge sağlar. Patolojik durumlarda, dolaşımdaki önemli ölçüde artmış EV’ler, özellikle beyin travması, preeklampsi, kırık ve çeşitli kanser türleri olan hastalarda hiper pıhtılaşmaya katkıda bulunur13. Günümüzde klinik laboratuvarlarda pıhtılaşma durumunun değerlendirilmesi öncelikle pıhtılaşma sisteminin, antikoagülasyon sisteminin ve fibrinolizin değerlendirilmesini içermektedir 14,15,16,17. Protrombin zamanı, aktive parsiyel tromboplastin zamanı, trombin zamanı ve uluslararası normalleştirilmiş oran, pıhtılaşma sistemindeki pıhtılaşma faktörü düzeylerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır18. Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu testlerin bazı hastalıkların hiper pıhtılaşabilirliğini tam olarak yansıtmadığını ortaya koymuştur19. Tromboelastometri (TEG), rotasyonel TEG ve Sonoklot analizi gibi diğer tahlil yöntemleri, tam kan viskoelastik değişikliklerini ölçer20,21. Tam kan örnekleri çok sayıda kan hücresi ve trombosit içerdiğinden, bu testlerin bir bütün olarak numunenin pıhtılaşma durumunu gösterme olasılığı daha yüksektir. Bazı araştırmacılar prokoagülan aktivitede kan hücrelerinin ve trombositlerin rolü hakkında rapor vermişlerdir 22,23. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, önceki pıhtılaşma fonksiyon testlerinin mikropartiküllerin prokoagülan aktivitesindeki değişiklikleri tespit etmede zorluklarla karşılaştığını da keşfetti24. Bu nedenle, EV’lerin prokoagülan fonksiyonunun, EV’den zengin plazmada aktive edilmiş pıhtılaşma süresinin (ACT) viskoelastik ölçümleri ile değerlendirilebileceğine dair bir hipotez öne sürülmüştür.
Bu çalışmada, EV’den zengin plazmanın hazırlanması tarif edildi ve yöntemin rasyonalitesi akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Daha sonra, rekalsifiye plazma örnekleri, viskoelastisite ilkelerine dayalı bir pıhtı analizörü kullanılarak ACT süresi için analiz edildi24. Şekil 3A’da gösterildiği gibi, ultrasantrifüjleme yoluyla elde edilen EV’lerin konsantrasyonunun EV-ACT süresini kısalttığı, ultrasantrifüjlemeden sonra EV seviyelerin…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, hibe no. 81930031, 81901525. Ayrıca, bize makine ve teknik rehberlik sağladığı için Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.’ye teşekkür ederiz.
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |