Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein hochauflösendes Respirometrie-Protokoll zur Analyse der Bioenergetik in PINK1 B9-Null-mutierten Fruchtfliegen vor. Die Methode verwendet das SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), und zelluläre Störungen wie Krebs sind einige der Erkrankungen, die den Energiestoffwechsel stören und die mitochondrialen Funktionen beeinträchtigen. Mitochondrien sind Organellen, die sowohl den Energiestoffwechsel als auch zelluläre Prozesse steuern, die am Überleben und Tod von Zellen beteiligt sind. Aus diesem Grund können Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Funktion wichtige Erkenntnisse über zelluläre Zustände in pathologischen und physiologischen Prozessen liefern. In diesem Zusammenhang ermöglichen hochauflösende Respirometrie-Protokolle (HRR) die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie und Bioenergetik genetisch und experimentell handhabbare Modelle wie Drosophila melanogaster.
Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, wie z. B. seine Ähnlichkeit mit der menschlichen Physiologie, seinen schnellen Lebenszyklus, seine einfache Wartung, seine Kosteneffizienz, seine hohe Durchsatzleistung und eine minimierte Anzahl ethischer Bedenken. Diese Eigenschaften machen es zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Analyse komplexer zellulärer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird erläutert, wie die Funktion der Mitochondrien mit Hilfe der Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-Mutante analysiert werden kann. Das pink1-Gen ist für die Kodierung der PTEN-induzierten putativen Kinase 1 verantwortlich, und zwar durch einen Prozess, der als Mitophagie bezeichnet wird und für die Entfernung dysfunktionaler Mitochondrien aus dem mitochondrialen Netzwerk entscheidend ist. Mutationen in diesem Gen wurden mit einer autosomal-rezessiven, früh einsetzenden familiären Form der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Dieses Modell kann verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion zu untersuchen, die an der Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit beteiligt ist.
Introduction
Mitochondrien sind zelluläre Organellen, die wichtige Funktionen steuern, darunter die apoptotische Regulation, die Kalziumhomöostase und die Beteiligung an Biosynthesewegen. Durch den Besitz von autonomem Erbgut sind sie in der Lage, zu zellulären Erhaltungs- und Reparaturprozessen beizutragen. Ihre Struktur beherbergt die Elektronentransportkette und die oxidative Phosphorylierung, die beide für die zelluläre Energie entscheidend sind 1,2,3. Insbesondere wird die Energiekontrolle durch die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS)2 erreicht. Eine Störung des Energiestoffwechsels mit Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen tritt sowohl beim Überleben als auch beim Tod der Zellen auf 4,5 und ist häufig mit einer Vielzahl von menschlichen Pathologien wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) verbunden3,6.
Parkinson ist eine chronische, fortschreitende und neurologische Erkrankung. Die Hauptursache für diese Krankheit ist das Absterben von Gehirnzellen, insbesondere in der Substantia nigra, die für die Produktion des Neurotransmitters Dopamin verantwortlich sind, der die Bewegung steuert 6,7,8. Die früheste Beobachtung, die Parkinsonismus mit mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung brachte, wurde 1988 in experimentellen Modellen gemacht, in denen Toxine verwendet wurden, die den Atmungskettenkomplex I9 hemmen.
Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion 10,11,12,1 3; Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen bietet die hochauflösende Respirometrie (HRR) jedoch eine überlegene Sensitivität und Vorteile13,14. HRR-Protokolle ermöglichen beispielsweise die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe 14,15. Mitochondriale Dysfunktionen können in intakten Zellen, isolierten Mitochondrien oder sogar ex vivo beurteilt werden 10,11,13,14.
Mitochondriale Dysfunktionen sind eng mit vielen pathologischen und physiologischen Prozessen verbunden. Daher ist es wichtig, die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik mit Hilfe genetisch und experimentell behandelbarer Modellsysteme zu untersuchen. In dieser Hinsicht hat die Forschung an Drosophila melanogaster, der Fruchtfliege, mehrere Vorteile. Dieses Modell teilt grundlegende zelluläre Eigenschaften und Prozesse mit dem Menschen, einschließlich der Verwendung von DNA als genetischem Material, gemeinsamen Organellen und konservierten molekularen Signalwegen, die an der Entwicklung, der Immunität und der Zellsignalisierung beteiligt sind. Darüber hinaus haben Fruchtfliegen einen schnellen Lebenszyklus, eine einfache Wartung, niedrige Kosten, einen hohen Durchsatz und weniger ethische Bedenken, was sie zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Analyse komplexer zellulärer Prozesse macht 16,17,18,19,20.
Darüber hinaus wird ein Homolog des PTEN-induzierten putativen Kinase-1-Gens (pink1) in D. melanogaster exprimiert. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Entfernung beschädigter Mitochondrien durch den Prozess der Mitophagie8. Beim Menschen prädisponieren Mutationen in diesem Gen Personen für eine autosomal-rezessive familiäre Form der Parkinson-Erkrankung, die mit einer mitochondrialen Dysfunktion assoziiertist 8,21,22,23. Folglich ist die Fruchtfliege ein leistungsfähiges Tiermodell für Studien zur Pathophysiologie von Parkinson und zum Screening von Wirkstoffkandidaten mit Schwerpunkt auf mitochondrialer Dysfunktion und Bioenergetik. Daher wird in der vorliegenden Arbeit erläutert, wie die mitochondriale Funktion in einem Modell der Parkinson-Krankheit von D. melanogaster unter Verwendung der HRR-Technik im OROBOROS mit dem Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-Protokoll analysiert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung und des Energiestoffwechsels in D. melanogaster und anderen Organismen. Es bietet eine detaillierte und quantitative Bewertung der mitochondrialen Funktion, die es den Forschern ermöglicht, Einblicke in die Bioenergetik der Zellen zu gewinnen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Bewertung der Funktion der mitochondrialen Atmungskette und der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe unter Verwendung des SUIT-Proto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der brasilianischen Agentur Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) und T.D. (#88887.512883/2020-00) sind Stipendiaten.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
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