Analysera mitokondriell funktion hos en Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant med hjälp av högupplöst respirometri
Summary
Här presenterar vi ett högupplöst respirometriprotokoll för att analysera bioenergetik i PINK1 B9-null-muterade bananflugor. Metoden använder protokollet Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD), och cellulära störningar som cancer är några av de sjukdomar som stör energimetabolismen med försämring av mitokondriella funktioner. Mitokondrier är organeller som styr både energimetabolism och cellulära processer som är involverade i cellöverlevnad och celldöd. Av denna anledning kan metoder för att utvärdera mitokondriell funktion ge viktiga insikter om cellulära förhållanden i patologiska och fysiologiska processer. I detta avseende möjliggör högupplösta respirometriprotokoll (HRR) utvärdering av hela den mitokondriella andningskedjans funktion eller aktiviteten hos specifika mitokondriella komplex. För att studera mitokondriell fysiologi och bioenergetik krävs dessutom genetiskt och experimentellt lätthanterliga modeller som Drosophila melanogaster.
Denna modell har flera fördelar, såsom dess likhet med mänsklig fysiologi, dess snabba livscykel, enkla underhåll, kostnadseffektivitet, höga genomströmningskapacitet och ett minimerat antal etiska problem. Dessa egenskaper gör det till ett ovärderligt verktyg för att dissekera komplexa cellulära processer. Det aktuella arbetet förklarar hur man analyserar mitokondriell funktion med hjälp av Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutanten. Pink1-genen är ansvarig för att koda för PTEN-inducerat förmodat kinas 1, genom en process som kallas mitofagi, vilket är avgörande för avlägsnandet av dysfunktionella mitokondrier från mitokondrienätverket. Mutationer i denna gen har associerats med en autosomalt recessiv tidigt debuterande familjär form av Parkinsons sjukdom. Denna modell kan användas för att studera mitokondriell dysfunktion som är involverad i patofysiologin vid Parkinsons sjukdom.
Introduction
Mitokondrier är cellulära organeller som styr viktiga funktioner, inklusive apoptotisk reglering, kalciumhomeostas och deltagande i biosyntetiska vägar. Genom att ha autonomt genetiskt material kan de bidra till cellulära underhålls- och reparationsprocesser. Deras struktur rymmer elektrontransportkedjan och oxidativ fosforylering, båda avgörande för cellulär energi 1,2,3. I synnerhet uppnås energikontroll genom produktion av adenosintrifosfat (ATP) via oxidativ fosforylering (OXPHOS)2. Störningar i energimetabolismen med försämring av mitokondriella funktioner förekommer både vid cellöverlevnad och celldöd 4,5, ofta förknippade med ett brett spektrum av mänskliga patologier, såsom cancer, och neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom (PD)3,6.
PD är en kronisk, progressiv och neurologisk sjukdom. Den främsta orsaken till denna sjukdom är döden av hjärnceller, särskilt i substantia nigra, som är ansvariga för produktionen av signalsubstansen dopamin, som styr rörelse 6,7,8. Den tidigaste observationen som kopplade Parkinsonism till mitokondriell dysfunktion gjordes 1988, i experimentella modeller med toxiner som hämmar andningskedjan Komplex I9.
För närvarande finns det flera metoder för att utvärdera mitokondriell dysfunktion 10,11,12,1 3; Jämfört med konventionella metoder ger dock högupplöst respirometri (HRR) överlägsen känslighet och fördelar13,14. Till exempel tillåter HRR-protokoll utvärdering av hela den mitokondriella andningskedjans funktion eller aktiviteten hos specifika mitokondriella komplex14,15. Mitokondriella dysfunktioner kan bedömas i intakta celler, isolerade mitokondrier eller till och med ex vivo 10,11,13,14.
Mitokondriella dysfunktioner är nära förknippade med många patologiska och fysiologiska processer. Det är därför viktigt att studera mitokondriell fysiologi och bioenergetik med hjälp av genetiskt och experimentellt lätthanterliga modellsystem. I detta avseende har forskning på bananflugan Drosophila melanogaster flera fördelar. Denna modell delar grundläggande cellulära egenskaper och processer med människor, inklusive användningen av DNA som genetiskt material, vanliga organeller och bevarade molekylära vägar som är involverade i utveckling, immunitet och cellsignalering. Dessutom har bananflugor en snabb livscykel, enkelt underhåll, låg kostnad, hög genomströmning och färre etiska problem, vilket utgör ett ovärderligt verktyg för att dissekera komplexa cellulära processer 16,17,18,19,20.
Dessutom uttrycks en homolog av den PTEN-inducerade förmodade kinas 1 (pink1)-genen i D. melanogaster. Det spelar en avgörande roll i avlägsnandet av skadade mitokondrier genom processen med mitofagi8. Hos människor predisponerar mutationer i denna gen individer för en autosomalt recessiv familjär form av PD associerad med mitokondriell dysfunktion 8,21,22,23. Bananflugan är därför en kraftfull djurmodell för studier av patofysiologin vid Parkinsons sjukdom och screening av läkemedelskandidater med fokus på mitokondriell dysfunktion och bioenergetik. Därför förklarar detta arbete hur man analyserar mitokondriell funktion i en modell av PD från D. melanogaster med hjälp av HRR-tekniken i OROBOROS med SUIT-protokollet (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR är en kraftfull teknik för att studera mitokondriell andning och energimetabolism i D. melanogaster och andra organismer. Det ger en detaljerad och kvantitativ bedömning av mitokondriell funktion, vilket gör det möjligt för forskare att få insikter i cellernas bioenergetik. Protokollet som presenteras här beskriver utvärderingen av mitokondriernas andningskedjefunktion och aktiviteten hos specifika mitokondriella komplex med hjälp av SUIT-protokollet i D. melanogaster. SUIT-protokollet inn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna uppmärksammar den brasilianska byrån Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) och T.D. (#88887.512883/2020-00) är mottagare av forskarstipendier.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
Riferimenti
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetica. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
