Summary
さまざまな性腺外組織および臓器における卵胞刺激ホルモン(FSH)は、複数の疾患の病因と関連しています。卵巣摘出術およびFSH処理マウスモデル(OVF)を使用して、FSHの性腺外作用を調べることができます。
Abstract
生殖期から非生殖期(閉経期)への移行期には、骨量の減少、血中脂質の増加、内臓脂肪の増加など、生理学的・病理学的に著しい変化が起こります。卵胞刺激ホルモン(FSH)のレベルは、閉経期に上昇します。多くの研究により、さまざまな性腺外組織および臓器におけるFSHが複数の疾患の病因と関連していることが示されています。したがって、in vivo でのFSHの独立した効果の研究に役立つ動物モデルを構築することは特に重要です。この研究では、C57BL / 6雌マウスに卵巣摘出を行い、吉草酸エストラジオール(OVX + E2)を補給して、視床下部-下垂体-生殖腺軸の影響を排除しました。OVX+E2マウスに溶媒(N.S.)または異なる用量の組換えFSHを腹腔内注射で投与し、比較的安定したエストロゲンとFSHレベルの上昇を特徴とするマウスモデル(OVF)を作製した。そこで、血清FSH値の上昇を特徴とする閉経移行の初期段階を模倣した実験的マウスモデルの作成に成功しました。OVFモデルには、安定性、低コスト、操作が簡単であるという利点があり、FSHの性腺外作用を調査する研究に適しています。ここでは、マウスOVFモデルの詳細なプロトコルについて説明します。
Introduction
卵胞刺激ホルモン(FSH)のレベルは、更年期の移行期に上昇します(更年期移行という用語は、2011年に生殖老化ワークショップ(STRAW)+10システムの段階で定義されました)1。FSHレベルの上昇と比較的安定したエストロゲン1を特徴とする閉経期には、女性が月経周期の変化とさまざまな細胞や組織を含む重要な生理学的変化を経験します。これらの変化は、女性の生活の質と健康に深刻な影響を与える可能性があります。FSHの効果を調べることで、女性の生活の質と健康が向上する可能性がある。
FSHは下垂体前葉の性腺刺激細胞から分泌され、性腺機能と生殖の制御に重要です2。FSHの機能は、Gタンパク質共役受容体(GPCR)3に属するFSH受容体(FSHR)を介して媒介されます。FSHRは一般に生殖腺、すなわち卵巣と精巣で発現します。FSHRは、肝臓4、海馬5、破骨細胞6、脂肪細胞7、内皮細胞8など、複数の性腺外細胞および組織に普遍的に発現していることが証明されています。新たな研究により、FSHの生殖腺外作用と、脂質異常症4、アルツハイマー病5、骨粗鬆症9,10、アテローム性動脈硬化症11、肥満9、および癌12における潜在的な臨床的関連性が明らかになりました。したがって、in vivoでのFSHの独立した効果を研究するのに役立つ動物モデルを構築することは、FSH単独の作用を調査する上で特に重要です。
プロトコールでは、エストロゲンが比較的安定し、FSHレベルが上昇するマウスモデルを確立するための手順を導入しました13。マウスモデルは、卵巣摘出手術による閉経移行を模倣し、吉草酸エストラジオールと組換えFSHを補充します。卵巣摘出マウスに外因性エストロゲンを添加し、偽手術マウスと同様のエストロゲンレベルを維持したところ、内因性FSHのレベルは下垂体でのエストロゲンフィードバックにより安定していました。この状態では、それはエストロゲンのレベルを変えないで外因性FSHの管理によってFSHのレベルを制御できます。したがって、OVFマウスモデルは、エストロゲンの影響を排除し、FSHの性腺外生理学的および病理学的影響を観察することができます。詳細で可視化された手順は、研究者が実験室でOVFマウスモデルを確立し、必要に応じて更年期移行期の生理学的および病理学的変化を調べるために適用することに役立つと考えています。
Protocol
以下のプロトコルは、研究動物の使用に関するすべての施設倫理ガイドラインに準拠しており、中国の山東省病院の動物倫理委員会によって承認されました。すべての外科的操作は深い麻酔下で行われ、動物は処置中のどの段階でも痛みを経験しませんでした。
1. 手術前の準備
- 器具の滅菌
- 手術前に手術器具をオートクレーブ(121°Cで15分間)で蒸気滅菌します。十分な使い捨て縫合糸と針を準備します。
- 手術プラットフォームのセットアップ
- 外科手術専用の部屋で手術を行います。操作には、少なくとも60 cm x 60 cmのベンチ領域を割り当てます。その部分の表面を75%アルコールで洗浄し、使い捨ての医療用タオルで覆い、30分前に紫外線で消毒します(図1A)。
- 動物の準備
- すべての動物を温度管理された部屋(20〜25°C)に、12時間の明るいサイクル、12時間の暗いサイクルで収容します。8週齢の雌のC57BL/6マウスを手術前の1週間、飼育施設に順応させる。
- 手術前にマウスの体重を量ります。すべての9週齢の雌マウスにトリブロモエタノール(280 mg / kg)の腹腔内注射による全身麻酔を投与し、処置中のどの段階でも痛みのない状態を達成します。痛みを和らげるために、手術の約1時間前にメロキシカム(2 mg / kg)を皮下に注射します。.
- 手術中の角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。
- 清潔な綿棒を使用して、背中に脱毛ローションを塗ります。ローションをマウスに3〜5分間置いてから、ガーゼと綿棒を使用して髪を取り除きます。マウスの背面からすべての髪の毛が取り除かれるまで、この手順を繰り返します。
- ガーゼと綿棒を使用して、75%アルコールで肌をきれいにします。ゴムストリップまたは綿ロープを使用してマウスを手術台に固定し(図1B)、ヨードフォア溶液を塗布して背面を清掃します。
注:卵巣摘出術の前に、つま先をつまんで麻酔の深さを確認してください。
2.卵巣摘出術
注:トリブロモエタノールは約30分間維持できるため、手術を可能な限り完了させることができます。
- 使い捨てメスを使用して、大腿部から上に向かって~1.0cmの背側切開を行い、皮膚と皮下筋膜のみを切開し、この時点で後腹膜に切り込まないようにします。
- 切開部を左に引くと、白い脂肪パッドが見えます。白色脂肪パッドに沿って~0.5cmカットし、マイクロ鉗子とハサミを使用して腹腔内を露出させます。
- 後腹膜を切開した後、マイクロ鉗子で腹腔内から白色脂肪パッドをゆっくりと優しく取り除きます。浸したガーゼの外側に0.9%滅菌生理食塩水で白色脂肪組織を直ちに湿らせます。腹腔の外側では、露出した組織を常に湿らせてください。
- ピンク色の粒状物質、すなわち卵巣が白い脂肪パッドの下部に付着しています(図2A)。卵巣は細い管、すなわち子宮に接続されています。5-0の吸収性縫合糸を使用して、子宮の卵巣端を結紮し、左卵巣を切除します(図2B)。
- 卵巣を摘出するときは、周囲の脂肪組織をできるだけ保存してください。手術器具と卵巣との直接接触を避け、卵巣組織の腹腔内移植を防ぎます。
- 白い脂肪パッドを腹腔内に慎重に戻します。後腹膜に5-0の吸収性縫合糸で簡単な断続的縫合を行います(図2C)。縫合が完了したら、0.9%滅菌生理食塩水に浸したガーゼで出血を取り除きます。
- 皮膚切開部を右に引っ張り、同じ方法で右卵巣を切除します。
- 4-0の非吸収性縫合糸で断続的に縫合を行い、0.9%滅菌生理食塩水に浸したガーゼで出血を取り除きます(図2D)。
- 両方の縫合を完了した後、ヨードフォア溶液で創傷を洗浄します。広域抗生物質を腹腔内に注射します。
3. 術後の観察
- 手術後、マウスを37°Cの恒温ブランケットに移します。マウスが自由に動けるようになるまで、動物を個別のケージに入れてください。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
- 手術後24時間でメロキシカム(2mg / kg)を皮下注射して痛みを和らげます。.
- マウスを毎日監視して、手術創が合併症(裂開)の兆候を示さずに適切に治癒していることを確認します。
4.エストラジオールの補給
- 吉草酸エストラジオールを添加した飼料を準備します。飼料1kgあたり2.6mgのβ-エストラジオール17-吉草酸を添加して使用します。
- 手術完了後3日目に、マウスに吉草酸エストラジオールを与えます。
5. FSHインジェクション
- 組換えヒトFSH溶液を調製する。注射用の組換えヒトFSH粉末を0.9%滅菌生理食塩水で100 IU/mLまで溶解します。
- 実験計画に従ってマウスをグループ化し、腹腔内注射で溶媒または異なる用量の組換えFSHを2週間投与します。組換えFSHの生物活性に応じて、閉経期移行期の女性の血清FSHレベルに相当するFSHの注射用量をマウスに使用します。
注:異なる治療に基づいて、卵巣摘出エストロゲン補充マウスを3つのグループにランダムに分けました、溶媒(NS)群は100μL /日の溶媒を投与され、低用量FSH(L-FSH)群は1日あたり15IU / kg体重を投与され、高用量FSH(H-FSH)グループは1日あたり30IU / kg体重を投与されました。
Representative Results
OVFマウスモデルは、閉経移行の初期段階を模倣しており、エストロゲンが比較的安定し、FSHレベルが上昇しています13。まず、卵巣摘出手術では、9週齢の雌のC57BL/6マウスに全身麻酔を投与し、偽手術(Sham)または両側卵巣摘出術(OVX)を行った。パパニコロウ染色細胞の塗抹画像により、発情期の前発情期、発情期、発情期、発情期が明確に同定されたため、OVXマウスは発情周期を失い(図3A)、ELISA法では血清エストラジオール(E2)レベルの有意な低下が見られました(図3B)。第二に、OVXマウスにβ-エストラジオール17-吉草酸(OVX + E2)を添加し、血清エストロゲンをシャム群と同じレベルに維持した。第三に、OVX + E2マウスに溶媒(N.S.)または異なる用量の組換えFSHを腹腔内注射で投与し、比較的安定したエストロゲンとFSHレベルの上昇を特徴とするマウスモデル(OVF)を作成しました(図4)。
図 1.手術環境とマウスの姿勢。 (A)手術用の少なくとも60 cm x 60 cmのベンチエリア。その部分の表面を75%アルコールできれいにし、使い捨ての医療用タオルで覆い、30分前に紫外線で消毒します。(B)ゴムストリップまたは綿ロープを使用して、マウスを手術台に固定します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 2.外科手術の重要なステップ。 (A)卵巣位置、(B)卵巣摘出術、(C)縫合腹膜、(D)縫合皮膚切開。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3.膣細胞診。 膣細胞診は、卵巣摘出マウス(OVX)および偽手術マウス(偽;偽;偽群ではn = 12、OVX群あたりn = 10)における発情周期と内因性エストロゲンの段階を表す。(A)膣細胞診は、白血球、角化上皮細胞、および有核上皮細胞の相対的な存在による発情周期の段階を表します。発情期の段階には、発情前、有核上皮細胞の優勢が含まれます。発情、摘出された角質細胞の優勢。metestrus、白血球の存在、および角化および有核上皮細胞。ジエストラス、白血球の優勢。スケールバー = 100 μm。 (B)卵巣摘出マウス(OVX)および偽手術マウス(Sham)の内因性エストロゲン。データはSEM±平均値として表示されます。 スチューデントのt検定は統計分析に使用されます。p< 0.001です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4.OVFモデルと血清ホルモンレベル。 (A)フローチャートOVFモデル。(B)血清エストロゲン(E2)およびFSH濃度のELISA分析。データはSEM±平均として表されます。 一元配置分散分析は統計分析に使用されました。* p< 0.05 および ** p< 0.01。この図は4 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
生殖期から非生殖期への移行期(閉経期)には、多くの女性が生理学的および病理学的に重大な変化を経験します。FSHのレベルは更年期への移行期に上昇します1.新たな研究により、さまざまな性腺外組織および臓器におけるFSHが、脂質異常症4、アルツハイマー病5、骨粗鬆症9,10、アテローム性動脈硬化症11、肥満9、癌12を含む複数の疾患の病因に重要であることが明らかになっています。したがって、in vivoでのFSHの独立した効果の研究に役立つ動物モデルを構築することは特に重要です。OVFマウスモデルは、エストロゲンが比較的安定し、FSHレベルが上昇する閉経移行の初期段階を模倣しており、FSHの性腺外作用を探る研究に特に適しています。
この方法では、大腿部基部から約1cm上方の背中側を1回切開して卵巣摘出術を行いました(図1B)。皮膚は鋭利な解剖ハサミで背側の筋肉とほぼ一緒に切断され、腹腔にアクセスされました。手術後、筋肉の切開は縫合を必要とせず、皮膚の傷は1本のキャットガット縫合糸で両側で閉じられました(図2)。この手術は、他の方法と比較して、技術的に簡単で、時間もかからず、雌マウスへの害も少ない。
手術中に注意すべきいくつかの詳細。まず、術後感染のリスクを減らすために、すべての外科的処置を清潔に保ち、できるだけ無菌状態に保つ必要があります。第二に、卵巣組織は非常に壊れやすいため、腹腔内移植を避けるために、手術器具は卵巣摘出術中に卵巣に直接接触することはできません。第三に、手術後、マウスを37°Cの恒温ブランケットに移し、術後の低体温症による死亡を防いだ。
以前の研究では、内因性エストロゲンが閉経前の女性の卵巣テカ細胞または閉経後の女性の乳房の脂肪間質細胞で合成され、末梢組織で少量合成されることが証明されています14。卵巣摘出マウスでは血清エストロゲンが急激に低下したが、排除することはできない(図3B)。しかし、性腺外組織で合成された内因性エストロゲンは、OVFモデルにおけるエストロゲンレベルの安定性に影響を与えません(図4B)。
OVF モデルにはいくつかの制限があります。外科手術が注意を怠り、卵巣腹腔内移植につながると、モデルの失敗につながる可能性があります。この場合、血清エストロゲンは急激に低下せず、発情周期のさまざまな段階で変動します。エストロゲンとFSHの外因性投与後、体が平衡に達するまでに約1週間かかります。したがって、1週間以内に発生するOVFモデルの病理学的変化は、FSHの影響を示すことはできません。
結論として、OVFモデルには、安定性、低コスト、操作が簡単であるという利点があります。高レベルのFSHの全身効果は、FSHの腹腔内注射後に観察できます。つまり、OVFモデルは、FSHの性腺外作用を探索する研究に適しています。しかし、模型手術や腹腔内注射手術の要件はかなり高いです。資金が十分な場合は、特定のノックアウトモデルが最良の選択です。
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
技術サポートをしてくれた山東省病院の動物研究所に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC 82101645)、中国山東省自然科学基金会(ZR2020QH088)、山東省大学青少年イノベーション科学技術支援計画(2021KJ051)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
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