Polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi for en etikettfri amyloid strukturell karakterisering

Summary

Dette papiret beskriver hvordan polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi kan brukes til å karakterisere den lokale organisasjonen innen etikettfrie amyloidoverbygninger-sfærulitter. Den beskriver også hvordan du forbereder og måler prøven, setter sammen det nødvendige oppsettet og analyserer dataene for å få informasjon om den lokale organisasjonen av amyloidfibriller.

Abstract

Sammenlignet med sin en-foton motpart, er to-foton excitasjon gunstig for bioimaging eksperimenter på grunn av sin lavere fototoksisitet, dypere vev penetrasjon, effektiv drift i tettpakkede systemer og redusert vinkelfotoseleksjon av fluoroforer. Dermed gir innføringen av polarisasjonsanalyse i to-foton fluorescensmikroskopi (2PFM) en mer presis bestemmelse av molekylær organisasjon i en prøve sammenlignet med standard bildebehandlingsmetoder basert på lineære optiske prosesser. I dette arbeidet fokuserer vi på polarisasjonsfølsom 2PFM (ps-2PFM) og dens anvendelse i bestemmelsen av molekylær rekkefølge innenfor komplekse biostrukturer-amyloidsfærulitter. Neurodegenerative sykdommer som Alzheimers eller Parkinsons blir ofte diagnostisert ved påvisning av amyloider-proteinaggregater dannet på grunn av en nedsatt proteinfoldingsprosess. Å utforske deres struktur fører til en bedre forståelse av deres skapelsesvei og følgelig til å utvikle mer følsomme diagnostiske metoder. Denne artikkelen presenterer ps-2PFM tilpasset for bestemmelse av lokal fibrilbestilling inne i bovine insulinsfærulitter og sfæriske amyloidogene proteinaggregater. Videre beviser vi at den foreslåtte teknikken kan løse den tredimensjonale organisasjonen av fibriller inne i sfærulitten.

Introduction

I løpet av de siste tiårene, selv om det har vært betydelig utvikling av mange fluorescensmikroskopiteknikker for bioimaging av proteiner og deres aggregater¹, har bare noen få blitt brukt til å løse deres lokale bestilling i prøven ^2,3. Fluorescens levetid imaging mikroskopi⁴ ble brukt til å studere den inneboende strukturelle heterogeniteten av amyloid overbygninger-sfærulitter. Videre kan kvantitativ bestemmelse av lokal orden i komplekse og tettpakkede biostrukturer som sfærulitter løses ved hjelp av polarisasjonsfølsomme metoder³. Imidlertid er standard fluorescensteknikker med overfladisk vevspenetrasjon begrenset, siden bruk av UV-VIS-bølgelengder for å eksitere fluoroforer in vivo fører til høy vevslysspredning⁵. I tillegg krever slik avbildning ofte å designe og binde spesifikke fluorescerende prober til et målrettet biomolekyl, og dermed øke kostnadene og mengden arbeid som trengs for å utføre bildebehandling.

Nylig, for å løse disse problemene, har teamet vårt tilpasset polarisasjonsfølsom to-foton eksitert fluorescensmikroskopi (ps-2PFM) for etikettfri avbildning av biologiske strukturer ^6,7. Ps-2PFM tillater måling av avhengigheten av to-foton fluorescensintensitet på retningen av lineær polarisering av eksitasjonsstrålen og analyse av polarisasjonen av den utstrålede fluorescensen⁸. Implementeringen av denne teknikken krever supplering av standard multi-foton mikroskopoppsett eksitasjonsbane (figur 1) med en halvbølgeplate for å kontrollere lyspolarisasjonsplanet. Deretter opprettes polare grafer, som viser avhengigheten av to-foton eksitert fluorescensintensitet på polarisasjonen av eksitasjonslaserstrålen, fra signaler samlet av to lavinefotodioder, og samler dermed de to, gjensidig vinkelrette komponentene av fluorescenspolarisasjon.

Det siste trinnet er dataanalyseprosessen, med tanke på virkningen av de optiske elementene, for eksempel dikroiske speil eller et høyt numerisk blenderåpningsmål, på polarisasjon. På grunn av naturen til to-foton prosessen, gir denne metoden både redusert vinkelfotoseleksjon og forbedret aksial oppløsning, da to-foton eksitasjon av fluoroforer utenfor fokalplanet er probabilistisk begrenset. Det ble også bevist at lignende metoder med hell kunne implementeres for in vivo-avbildning av nær-infrarøde sonder (NIR) for dypvevsavbildning⁹. Ps-2PFM har tidligere blitt brukt på bildefluoroforer i cellemembraner¹⁰ og DNA^11,12, samt ikke-standardiserte fluorescerende markører for biologiske systemer, for eksempel gullnanopartikler¹³. Men i alle disse eksemplene ble informasjonen om organisering av biomolekyler oppnådd indirekte og krevde en forhåndsdefinert gjensidig orientering mellom en fluorofor og en biomolekyl.

I en av våre siste papirer har vi vist at ps-2PFM kunne brukes til å bestemme den lokale polarisasjonen av autofluorescensen av amyloidoverbygninger og fluorescens fra Thioflavin T, et amyloidspesifikt fargestoff, bundet til amyloidfibriller i sfærulitter⁶. Videre har vi i en annen vist at ps-2PFM kunne brukes til å oppdage amyloidfibrilorientering inne i amyloidsfærulitter i et submikronstørrelsesregime, som ble bekreftet ved å korrelere det med transmisjonselektronmikroskopi (TEM) avbildning⁷. Oppnåelsen av dette resultatet var mulig takket være i) inneboende autofluorescens av sfærulitter-amyloider, når de er begeistret med enten en eller to fotoner, utviser inneboende autofluorescens med utslippsmaksima lokalisert i et område fra 450 til 500 nm og to-foton absorpsjonstverrsnitt sammenlignbare med standard fluorescerende fargestoffer¹⁴, ii) matematiske modeller introdusert tidligere for å beskrive hvordan ps-2PEF av fargestoffer som merker biologiske membraner og DNA-strukturer kan brukes på fluorescens utvist av sfærulitter og fargestoffer bundet til dem ^8,11,15. Før vi går videre med analysen, anbefaler vi derfor å se gjennom den nødvendige teorien beskrevet i begge, hovedteksten og støtteinformasjonen til vårt første papir om dette emnet⁶. Her presenterer vi protokollen for hvordan man bruker ps-2PFM-teknikken for en etikettfri amyloidstrukturell karakterisering av bovine insulinsfærulitter.

Protocol

1. Klargjøre mikroskoplysbildene med fullvoksne sfærulitter MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen. Alle løsningene ble fremstilt med avionisert vann (18,2 MΩ·cm ved 25 °C) oppnådd fra vannrensesystemet. Inkubere amyloid sfærulitter basert på protokollen beskrevet av Krebs et al16. med noen modifikasjoner, som beskrevet nedenfor.<l…

Representative Results

Den presenterte protokollen gir trinnvis veiledning gjennom fremstilling av amyloidoverbygninger for testing med ps-2PFM, konstruksjon av det mikroskopiske systemet og målinger av riktig prøve. Før det endelige settet med målinger er det imidlertid viktig å justere APD-ene riktig med en isotropisk referanse, noe som skal resultere i å samle et symmetrisk signal med lignende form og intensitet på begge detektorene (figur 4C). Selv minimale forskjeller mellom intensitetene målt på det…

Discussion

Polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere lokal rekkefølge av fibriller inne i amyloidoverbygningene, og krever bare små modifikasjoner av standard multifotonoppsett. Siden den opererer på ikke-lineære optiske fenomener, kan redusert vinkelfotoseleksjon og forbedret aksial oppløsning oppnås sammenlignet med en-foton eksitert fluorescensmikroskopimetoder. I tillegg fører det til lavere lysspredning, lavere fototoksisitet og dypere prøvepenetrasjon sammenlignet med en-foton e…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5