인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템
Summary
여기서는 자동화된 세포 배양 시스템을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 자동 배양 시스템은 iPS 세포의 유지에서 다양한 유형의 세포로의 분화에 이르기까지 유도만능줄기세포(iPS) 세포 취급에 익숙하지 않은 연구자를 포함하여 노동력을 줄이고 사용자에게 이점을 제공합니다.
Abstract
무한 자가증식 능력을 가진 인간유도만능줄기세포(hiPSC)는 희귀질환 병리의 해명, 신약 개발, 손상된 장기의 복원을 목표로 하는 재생의학 등 다양한 분야에서 응용될 것으로 기대되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 hiPSC의 사회적 구현은 여전히 제한적입니다. 이는 부분적으로는 고급 지식과 정교한 기술로도 미세한 환경 변화에 대한 iPSC의 높은 민감성으로 인해 배양에서 분화를 재현하기 어렵기 때문입니다. 자동 배양 시스템을 적용하면 이 문제를 해결할 수 있습니다. 연구자의 기술과 무관하게 재현성이 높은 실험은 여러 기관에서 공유하는 절차에 따라 기대할 수 있습니다. iPSC 배양을 유지하고 분화를 유도할 수 있는 여러 자동 배양 시스템이 이전에 개발되었지만, 이러한 시스템은 인간화된 다중 관절 로봇 팔을 사용하기 때문에 무겁고 크며 비용이 많이 듭니다. 위의 문제를 개선하기 위해 간단한 x-y-z 축 슬라이드 레일 시스템을 사용하여 더 작고 가벼우며 저렴하게 사용할 수 있는 새로운 시스템을 개발했습니다. 또한 사용자는 새로운 시스템에서 매개변수를 쉽게 수정하여 새로운 처리 작업을 개발할 수 있습니다. 작업이 설정되면 사용자는 iPSC를 준비하고, 원하는 작업에 필요한 시약 및 소모품을 미리 공급하고, 작업 번호를 선택하고, 시간을 지정하기만 하면 됩니다. 이 시스템은 공급세포가 없는 여러 통로를 통해 iPSC를 미분화 상태로 유지하고 심근세포, 간세포, 신경 전구세포, 각질형성 세포 등 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있음을 확인했습니다. 이 시스템은 숙련된 연구원 없이도 기관 전반에 걸쳐 재현성이 높은 실험을 가능하게 할 것이며, 새로운 진입에 대한 장애물을 줄임으로써 더 넓은 범위의 연구 분야에서 hiPSC의 사회적 구현을 촉진할 것입니다.
Introduction
본 논문은 당사가 기업과 공동으로 제작한 인체유도만능줄기세포(iPSC)의 자동배양 시스템에 대한 실제적이고 상세한 취급 절차를 제공하고 대표적인 결과를 제시하고자 합니다.
2007년 논문이 발표된 이래 iPSC는 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다1. 모든 종류의 체세포로 분화할 수 있는 가장 큰 특징으로 인해 재생의학, 난치성 질환의 원인 규명, 새로운 치료약 개발 등 다양한 분야에 적용될 것으로 기대된다 2,3. 또한 인간 iPSC 유래 체세포를 사용하면 상당한 윤리적 제한이 적용되는 동물 실험을 줄일 수 있습니다. iPSC를 이용한 새로운 분석법을 연구하기 위해서는 수많은 동종 iPSC가 지속적으로 필요하지만 이를 관리하는 것은 너무 힘들다. 더욱이 iPSC는 미묘한 문화적, 환경적 변화에도 민감하게 반응하기 때문에 취급이 어렵습니다.
이 문제를 해결하기 위해 자동화된 배양 시스템은 인간 대신 작업을 수행해야 합니다. 일부 그룹은 세포 유지 및 분화를 위해 몇 가지 자동화된 인간 만능 줄기 세포 배양 시스템을 개발했으며 그 성과를 발표했습니다 4,5,6. 이 시스템에는 다중 관절 로봇 팔이 장착되어 있습니다. 로봇 팔은 인간의 팔 움직임을 매우 모방한다는 점에서 장점이 있을 뿐만 아니라 팔에 더 높은 비용, 더 크고 무거운 시스템 패키징, 목표 동작을 얻기 위해 엔지니어의 시간 소모적인 교육 노력이 필요하다는 단점도 있습니다 7,8. 경제적, 공간적, 인적 자원 소비 측면에서 더 많은 연구 시설에 장치를 더 쉽게 도입할 수 있도록 iPSC를 다양한 세포 유형으로 유지 및 분화하기 위한 새로운 자동 배양 시스템을 개발했습니다9.
새로운 시스템에 대한 우리의 이론적 근거는 다관절 로봇 팔9 대신 X-Y-Z 축 레일 시스템을 채택하는 것이었습니다. 로봇 팔의 복잡한 손과 같은 기능을 대체하기 위해 우리는 이 시스템에 새로운 아이디어를 적용하여 세 가지 유형의 특정 기능 팔 팁을 자동으로 변경할 수 있습니다. 여기에서는 프로세스 전반에 걸쳐 엔지니어의 기여에 대한 요구 사항이 없기 때문에 사용자가 소프트웨어에서 간단한 주문으로 작업 일정을 쉽게 만들 수 있는 방법도 나타냅니다.
로봇 배양 시스템 중 하나는 분화를 위한 3D 세포 응집체로 96웰 플레이트를 사용하여 배아체를 만드는 것을 시연했습니다4. 여기에 보고된 시스템은 96웰 플레이트를 처리할 수 없습니다. 하나는 인간 만능 줄기 세포가 아니었지만 세포주를 사용하여 현재의 우수 제조 관리 기준(cGMP) 등급을 달성했습니다5. 여기에 자세히 설명된 자동 배양 시스템은 이제 실험실 실험을 돕기 위한 특정 목적으로 개발되었습니다(그림 1). 그러나 레벨 IV 안전 캐비닛과 동등한 수준의 청결을 유지하기에 충분한 시스템을 갖추고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요한 단계는 사용자가 오류를 발견하면 언제든지 취소, 중지 또는 재설정 버튼을 클릭하고 첫 번째 단계부터 다시 시작하는 것입니다. 이 소프트웨어는 이중 예약, 시스템 작업이 활성화된 동안 문 열기, 보충 부족 등 사람의 실수를 방지할 수 있습니다. 원하는 체세포에 대한 성공적이고 효율적인 분화를 위한 또 다른 임계점은 만능 줄기세포주의 적절한 선택인데, 그 이유는 각각?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 오사카에 있는 Panasonic Production Engineering Co., Ltd.의 New Business Promotion Center의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
Riferimenti
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