Caratterizzazione della morfologia vascolare della degenerazione maculare neovascolare legata all'età mediante angiografia con verde indocianina

Summary

Attualmente, l’angiografia con fluoresceina (FA) è il metodo preferito per identificare i modelli di perdita nei modelli animali di neovascolarizzazione coroideale (CNV). Tuttavia, la FA non fornisce informazioni sulla morfologia vascolare. Questo protocollo delinea l’uso dell’angiografia con verde di indocianina (ICGA) per caratterizzare diversi tipi di lesioni di CNV indotta da laser in modelli murini.

Abstract

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una delle principali cause di cecità tra gli anziani e la sua prevalenza è in rapido aumento a causa dell’invecchiamento della popolazione. La neovascolarizzazione coroideale (CNV) o AMD umida, che rappresenta il 10%-20% di tutti i casi di AMD, è responsabile di un allarmante 80%-90% di cecità correlata all’AMD. Le attuali terapie anti-VEGF mostrano risposte subottimali in circa il 50% dei pazienti. La resistenza al trattamento anti-VEGF nei pazienti con CNV è spesso associata alla CNV arteriolare, mentre i responder tendono ad avere CNV capillare. Sebbene l’angiografia con fluoresceina (FA) sia comunemente utilizzata per valutare i modelli di perdita nei pazienti con AMD umida e nei modelli animali, non fornisce informazioni sulla morfologia vascolare della CNV (CNV arteriolare vs. CNV capillare). Questo protocollo introduce l’uso dell’angiografia con verde indocianina (ICGA) per caratterizzare i tipi di lesione in modelli murini di CNV indotti da laser. Questo metodo è fondamentale per studiare i meccanismi e le strategie di trattamento per la resistenza anti-VEGF nell’AMD umida. Si raccomanda di incorporare l’ICGA insieme alla FA per una valutazione completa delle caratteristiche sia della perdita che delle caratteristiche vascolari della CNV negli studi meccanicistici e terapeutici.

Introduction

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una condizione prevalente che porta a una grave perdita della vista negli individui anziani¹. Solo negli Stati Uniti, si prevede che il numero di pazienti affetti da AMD raddoppierà, raggiungendo quasi 22 milioni entro il 2050, rispetto agli attuali 11 milioni. A livello globale, si prevede che il numero stimato di casi di AMD raggiungerà l’incredibile cifra di 288 milioni entro il 2040².

La neovascolarizzazione coroideale (CNV), nota anche come AMD “umida” o neovascolare, può avere effetti devastanti sulla vista a causa della formazione di vasi sanguigni anomali sotto la retina centrale. Ciò porta a emorragie, essudazione della retina e significativa perdita della vista. L’introduzione di terapie anti-fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), che hanno come bersaglio il VEGF extracellulare, ha rivoluzionato il trattamento della CNV. Tuttavia, nonostante questi progressi, fino al 50% dei pazienti mostra risposte non ottimali a queste terapie, con attività di malattia in corso come accumulo di liquidi ed emorragie irrisolte o nuove 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Studi clinici hanno indicato che la resistenza anti-VEGF nei pazienti con CNV spesso corrisponde alla presenza di CNV arteriolare, caratterizzata da arteriole ramificate di grosso calibro, anse vascolari e connessioni anastomotiche⁹. Il trattamento anti-VEGF ripetuto può contribuire all’anomalia dei vasi, allo sviluppo della CNV arteriolare e, in ultima analisi, alla resistenza alle terapie anti-VEGF^14,15. Nei casi di CNV arteriolare, è probabile che la perdita persistente di liquido sia dovuta all’essudazione accentuata causata da giunzioni strette non adeguatamente formate nelle anse anastomotiche arterovenose, in particolare in condizioni di elevato flusso sanguigno⁹. Al contrario, gli individui che rispondono bene al trattamento anti-VEGF tendono a mostrare CNV capillare.

Nei nostri studi che utilizzano modelli animali, abbiamo dimostrato che la CNV indotta dal laser nei topi più anziani sviluppa CNV arteriolare e mostra resistenza al trattamento anti-VEGF^16,17. Al contrario, la CNV indotta dal laser nei topi più giovani porta allo sviluppo di CNV capillare e a un’elevata reattività al trattamento anti-VEGF. Pertanto, è fondamentale differenziare tra i tipi vascolari di CNV sia per le indagini meccanicistiche che per quelle terapeutiche.

In ambito clinico, la CNV è comunemente classificata in base ai modelli di perdita di fluorangiografia (FA) (ad esempio, Tipo 1, Tipo 2), che utilizzano il colorante fluoresceina per tracciare l’essudazione e identificare le aree di perdita patologica. Nella ricerca sull’AMD, la CNV viene studiata prevalentemente utilizzando la FA in modelli animali. Tuttavia, la FA non riesce a rivelare la morfologia vascolare della CNV. Inoltre, la FA cattura solo le immagini nello spettro della luce visibile e non può visualizzare la vascolarizzazione coroideale sotto l’epitelio pigmentato retinico (RPE). Al contrario, il verde indocianina (ICG), che mostra una forte affinità per le proteine plasmatiche, facilita la ritenzione intravascolare predominante e consente la visualizzazione della struttura vascolare e del flusso sanguigno⁹. Utilizzando la proprietà di fluorescenza nel vicino infrarosso dell’ICG, diventa possibile visualizzare il pigmento retinico e coroideale utilizzando l’angiografia ICG (ICGA). In questo contesto, viene presentato un protocollo che combina FA e ICGA per studiare la perdita e la morfologia vascolare della neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta dal laser in topi giovani e anziani, dove si osservano CNV capillari e arteriolari.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali condotti in questo studio hanno ricevuto l’approvazione da parte dei comitati istituzionali per la cura e l’uso degli animali (IACUC) presso il Baylor College of Medicine. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida delineate nella Dichiarazione dell’Associazione per la Ricerca sulla Visione e l’Oftalmologia (ARVO) per l’Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e sulla Visione. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6J giovani (…

Representative Results

Seguendo il protocollo, ICGA e FA sono stati eseguiti su CNV indotta da laser in topi C57BL/6J giovani (7-9 settimane) e vecchi (12-16 mesi). La FA fornisce informazioni sulla localizzazione e la fuoriuscita delle lesioni CNV (Figura 1, pannelli di sinistra), mentre l’ICGA rivela la morfologia vascolare delle lesioni CNV (Figura 1, pannelli di destra). Nei topi giovani, la CNV capillare domina le lesioni della CNV. Al contrario, i topi anziani mostrano CNV arter…

Discussion

Questo studio ha dimostrato l’uso dell’angiografia con verde indocianina (ICGA) per identificare la morfologia vascolare della neovascolarizzazione coroideale arteriolare e capillare (CNV) in modelli murini con CNV indotta da laser. Le proprietà legate all’emoglobina e alla luce infrarossa del colorante verde indocianina (ICG) hanno permesso di rilevare la morfologia della CNV, che è difficile da ottenere utilizzando l’angiografia con fluoresceina (FA), l’attuale metodo impiegato dalla comunità di ricerca.

<p clas…

Materials

32-G Insulin Syringe	MHC Medical Products	NDC 08496-3015-01
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008
Anti-α smooth muscle Actin antibody	Abcam	ab5694
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-2323
C57BL/6J mice (7-9 weeks)	The Jackson Laboratory	Strain #:000664
Fluorescein Sodium Salt	Sigma-Aldrich	MFCD00167039
Gaymar T Pump Heat Therapy System	Gaymar	TP-500	Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	Clear lubricant eye gel
GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate	Invitrogen	I21412
Heidelberg Eye Explorerer	Heidelberg Engineering, Germany	HEYEX2
Indocyanine Green	Pfaultz & Bauer	I01250
Ketamine	Vedco Inc.	NDC 50989-996-06
Paraformaldehyde	Acros Organics	416785000
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Sandoz	NDC 61314-016-01
Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	For dilation of pupils
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236