عزل وزراعة خلايا شعر القوقعة الأولية من الفئران حديثي الولادة
Summary
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة خلايا شعيرات القوقعة الأولية من الفئران. في البداية ، تم تشريح عضو كورتي من قوقعة الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام) تحت المجهر. بعد ذلك ، تم هضم الخلايا إنزيميا في تعليق خلية واحدة وتحديدها باستخدام التألق المناعي بعد عدة أيام في الثقافة.
Abstract
خلايا شعر القوقعة هي المستقبلات الحسية للنظام السمعي. تقع هذه الخلايا في عضو كورتي ، العضو الحسي المسؤول عن السمع ، داخل المتاهة العظمية للأذن الداخلية. تتكون خلايا شعيرات القوقعة من نوعين متميزين تشريحيا ووظيفيا: خلايا الشعر الخارجية والداخلية. الأضرار التي لحقت أي منهما يؤدي إلى فقدان السمع. والجدير بالذكر أن خلايا الشعر الداخلية لا يمكن أن تتجدد ، والضرر الذي يلحق بها دائم. ومن ثم، فإن زراعة خلايا الشعر الأولية في المختبر أمر لا غنى عنه للتحقيق في الآثار الوقائية أو التجديدية لخلايا الشعر القوقعي. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر.
بعد الإزالة اليدوية للجدار الجانبي للقوقعة ، تم تشريح الظهارة السمعية بدقة من القوقعة تحت المجهر ، وتم تحضينها في خليط يتكون من 0.25٪ trypsin-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتم تعليقها برفق في وسط الاستزراع باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. تم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح الخلية ، وتم طرد المرشح بالطرد المركزي ، وتم استزراع الخلايا في 24 لوحة بئر. تم تحديد خلايا الشعر بناء على قدرتها على التعبير عن مركب النقل الميكانيكي ، الميوسين-VIIa ، الذي يشارك في التوترات الحركية ، وعن طريق وضع العلامات الانتقائية على F-actin باستخدام phalloidin. وصلت الخلايا إلى التقاء >90٪ بعد 4 د في الثقافة. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للخصائص البيولوجية لخلايا الشعر المستزرعة في المختبر وتوضح كفاءة مزارع خلايا الشعر القوقعة ، مما يضع أساسا منهجيا متينا لمزيد من البحث السمعي.
Introduction
تلعب خلايا شعيرات القوقعة أدوارا مهمة في اكتشاف الصوت ونقل الإشارات إلى العصب السمعي. خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تعمل كمستقبلات حسية أولية وتحول الاهتزازات الصوتية إلى إشارات كهربائية في الفقاريات. تتكون الظهارة الحسية للأذن الداخلية للثدييات من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجية. في مناطق الغشاء الأساسية المختلفة ، تدرك خلايا الشعر الأصوات بترددات مختلفة (بين 20 و 2000 هرتز)1. وظيفة خلايا الشعر الخارجية هي عملية تضخيم ميكانيكية نشطة تساعد على ضبط الأذن الداخلية للثدييات ، مما يمنح حساسية عالية للصوت. خلايا الشعر الداخلية هي المسؤولة عن اكتشاف الأصوات. بعد إزالة الاستقطاب المتدرج ، تنتقل المعلومات الصوتية إلى الدماغ من خلال الألياف العصبية السمعية2.
قد يحدث فقدان السمع بسبب العيوب الوراثية أو الشيخوخة أو صدمة الضوضاء أو الاستخدام المفرط للأدوية السامة للأذن ، والتي تشكل مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم 3,4. ينتج فقدان السمع بشكل رئيسي عن تلف لا رجعة فيه لخلايا الشعر5. فيما يتعلق بفقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، على الرغم من توصل الباحثين إلى توافق في الآراء حول العديد من تفاصيل مسبباته ، إلا أنه لا يوجد فهم شامل للعديد من الآليات الأساسية. خلايا الشعر الخارجية معرضة بشكل خاص للتعرض المفرط السمعي6. تشارك خلايا شعر القوقعة الحساسة ميكانيكيا في فقدان السمع المرتبط بالعمر. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تنكس خلايا الشعر لا تزال غير معروفة. تؤدي العديد من التغييرات في العمليات الجزيئية إلى شيخوخة خلايا الشعر ، والإجهاد التأكسدي ، واستجابة تلف الحمض النووي ، والالتهام الذاتي ، وعدم تنظيم التعبير عن الجينات المتعلقة بتخصص خلايا الشعرونسخها 7.
نظرا لأن الأذن الداخلية مغلفة بالعظم الصدغي ، في عمق أصعب عظام الجسم ، فلا يمكن الوصول إليها تجريبيا ، مما يشكل تحديا للتحقيقات في آليات إصلاح خلايا الشعر وتجديدها. ومن ثم ، أصبح إنشاء مزارع في المختبر للتحقيق في وظيفة خلايا الشعر طريقة مثالية للبحث في آليات التجديد والإصابة في الأذن الداخلية. تم وصف إجراءات تحضير مزارع النمط العضوي للقوقعة في الدراسات السابقة8،9،10. استخدم الباحثون في جميع أنحاء العالم تقنيات مختلفة لتشريح القوقعة الصناعية وإعداد السطح. على الرغم من التحديات المستمرة ، تم إنشاء العديد من أنظمة زراعة خلايا الشعر الأولية بنجاح في المختبر. تحتوي مزارع أعضاء القوقعة الصناعية على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك خلايا الشعر، وخلايا ديتر، وخلايا هينسن، وخلايا الأعمدة، والألياف العصبية السمعية. إن الفهم المتعمق للتغيرات في خلايا الشعر على المستويين الخلوي والجزيئي بعد الإصابة سيمكن من تطوير أدوات بحث أكثر قوة. هدفت هذه الدراسة إلى توضيح خطوات عزل أعضاء القوقعة من الفئران الوليدية وفصل خلايا الشعر الوفيرة إنزيميا للدراسات في المختبر. تم تأكيد طبيعة الخلايا المستزرعة باستخدام تلطيخ المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمقارنة مع خط خلايا HEI-OC1 ، فإن الثقافات الأولية لخلايا الشعر تكرر بدقة أكبر الحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي. لذلك ، يبدو أن طريقة الزراعة الأولية السمعية التي تم إنشاؤها عن طريق عزل الخلايا الحية عن أعضاء القوقعة وزراعتها على الفور هي أداة قيمة لإجراء أبحاث مكثفة حول الأنظمة ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NFSC 82101224 إلى YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
