Um Método Eficiente e Reprodutível para Produção de Compósitos por Transformação de Raízes Pelosas à Base de Agrobacterium rhizogenes
Summary
Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.
Abstract
A produção de plantas compostas com raízes transgênicas e caules e gemas não transgênicas usando a transformação de raízes pilosas mediada por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta poderosa para estudar a biologia relacionada às raízes. A transformação de raízes pilosas é estabelecida em uma ampla gama de dicotiledôneas e em várias espécies de monocotiledôneas e é quase independente do genótipo. O método tradicional de injeção de hipocótilo com A. rhizogenes para obtenção de plantas compostas é ineficiente, demorado, trabalhoso e frequentemente causa a morte de plantas tenras e minúsculas de hipocótilo. Uma transformação radicular pilosa altamente eficiente, de uma etapa, mediada por A. rhizogenes , foi estabelecida previamente, o que elimina a necessidade de transplante após a produção de raízes pilosas. Neste estudo, um hipocótilo parcial e uma raiz primária foram removidos, o local da incisão do hipocótilo foi recoberto com A. rhizogenes e, em seguida, os hipocótilos foram plantados em vermiculita estéril. Após 12 dias de cultivo, a incisão do hipocótilo expandiu-se e novas raízes pilosas foram induzidas. Este artigo fornece o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por A. rhizogenes, com sua eficácia demonstrada pela produção de plantas compostas de soja silvestre, Solanum americanum e abóbora.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria gram-negativa do solo da família Rhizobiaceae. A. rhizogenes pode infectar quase todas as dicotiledôneas, algumas monocotiledôneas e gimnospermas individuais através de feridas, produzindo raízes pilosas em plantas infectadas. A bactéria carrega o plasmídeo Ri (indutor de raízes), e o T-DNA do plasmídeo Ri carrega o gene de síntese de opina e os genes rol (genes do locus radicular). Após o DNA-T do plasmídeo Ri entrar em uma célula vegetal e se integrar a um cromossomo hospedeiro, a expressão dos genes rol induz a produção de raízes pilosas1. Um vetor de expressão binária de planta que carrega um gene alvo é transformado em A. rhizogenes, e o A. rhizogenes transformado é usado para infectar uma planta. Raízes transgênicas podem ser induzidas em plantas infectadas, produzindo plantas compostas contendo raízes transgênicas e caules e gemas não transgênicas. Geralmente, uma planta composta pode ser obtida dentro de 14-20 dias. A transformação de raízes pilosas mediada por A. rhizogenes geralmente não é limitada pelo genótipo em plantas dicotiledôneas2. As raízes pilosas produzidas por plantas infectadas por A. rhizogenes são caracterizadas por uma rápida taxa de crescimento, herança estável e fácil operação. A transformação de raízes pilosas mediada por A. rhizogenes é atualmente amplamente utilizada para estudar a biologia relacionada às raízes. Além disso, a transformação de raízes pilosas também pode ser usada para validar e otimizar a eficiência de edição de alvos do sistema CRISPR/Cas9 3,4,5 e a localização subcelular de proteínas. Portanto, a transformação de raízes pilosas é uma importante ferramenta em pesquisas sobre função gênica de plantas, engenharia metabólica e interações entre raízes e microrganismos rizosféricos 6,7,8.
Plantas compostas contendo raízes transgênicas obtidas através da transformação de raízes pilosas têm sido amplamente produzidas em plantas dicotiledôneas, especialmente em leguminosas. O método tradicional de injeção do hipocótilo com A. rhizogenes tem sido utilizado para produzir o composto Lotus corniculatus9, soja10, tomate 11, batata-doce12 e muitas outras plantas 5,8. O método de injeção de hipocótilo é ineficiente e é provável que cause a morte de plantas jovens ou minúsculas de hipocótilo. Para tanto, o método foi aprimorado com o corte das raízes embrionárias, o revestimento da incisão das plântulas com A. rhizogenes e, em seguida, a colocação do hipocótilo em meio de cultura estéril para o cultivo do enraizamento13. No entanto, essas etapas são executadas em um ambiente estéril e as etapas de operação são relativamente complicadas. Em particular, as plantas compostas resultantes precisam ser transplantadas, o que aumenta a quantidade de trabalho. Em trabalhos anteriores, a transformação da raiz pilosa mediada por A. rhizogenes (ARM) em uma etapa foi estabelecida em pepino, soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula, e tomate 2,14,15,16,17. A raiz primária e o hipocótilo parcial foram removidos, o local da incisão do hipocótilo remanescente foi revestido com A. rhizogenes transformado e, em seguida, a plântula foi plantada em vermiculita estéril úmida. Após 12 dias de cultivo, raízes pilosas foram produzidas no local da incisão. O método ARM de uma etapa é altamente eficiente e requer menos tempo para produzir raízes pilosas. O transplante após a formação de raízes pilosas também não é necessário. Como a contaminação microbiana pode ser evitada sem transplante, o método ARM em uma etapa pode ser particularmente útil no estudo de interações entre plantas e microrganismos, como fixação simbiótica de nitrogênio entre leguminosas e rizóbios, e simbioses entre plantas e fungos micorrízicos arbusculares. Neste trabalho, um protocolo detalhado de transformação de raízes pilosas mediado por A. rhizogenes em uma etapa é fornecido com exemplos de plantas compostas produzidas em soja selvagem, Solanum americanum e abóbora. Com o protocolo, os pesquisadores podem realizar sem problemas a transformação do ARM em uma etapa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de raiz pilosa mediada por A. rhizogenes em uma etapa é um método mais simples e eficiente para a produção de plantas compostas do que o método de injeção de hipocótilo. O método ARM de uma etapa melhora significativamente a eficiência da transformação de raízes pilosas, encurta o tempo para produzir raízes pilosas, aumenta o número de raízes pilosas e reduz a quantidade de trabalho envolvido. O protocolo de transformação aprimorado é ideal para estudos de simbioses entre leguminosas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Universidade de Liaocheng (318012028) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
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