Diagnostic rapide quantitatif par réaction en chaîne par polymérase (qPCR) de l’infection à Helicobacter pylori et de la résistance aux antibiotiques
Summary
Le protocole présente une méthode non invasive pour le diagnostic rapide des infections de l’estomac à Helicobacter pylori par le test de corde et détermine sa résistance aux antibiotiques à la clarithromycine et à la lévofloxacine en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR).
Abstract
Helicobacter pylori est un agent pathogène humain majeur qui infecte environ la moitié de la population mondiale et devient une menace sérieuse pour la santé en raison de sa résistance croissante aux antibiotiques. C’est l’agent causal de la gastrite chronique active, de l’ulcère gastroduodénal et du cancer gastrique et a été classé comme cancérogène du groupe I par le Centre international de recherche sur le cancer. Par conséquent, le diagnostic rapide et précis de H. pylori et la détermination de sa résistance aux antibiotiques sont importants pour l’éradication efficace de ce pathogène bactérien. Actuellement, les méthodes de diagnostic de H. pylori comprennent principalement le test respiratoire à l’urée (UBT), le test antigénique, le test d’anticorps sériques, la gastroscopie, le test rapide d’uréase (RUT) et la culture bactérienne. Parmi elles, les trois premières méthodes de détection sont non invasives, ce qui signifie qu’elles sont faciles à effectuer. Cependant, les bactéries ne peuvent pas être récupérées par ces techniques; Par conséquent, les tests de résistance aux médicaments ne peuvent pas être effectués. Les trois derniers sont des examens invasifs, mais ils sont coûteux, nécessitent des compétences élevées et ont le potentiel de causer des dommages aux patients. Par conséquent, une méthode non invasive, rapide et simultanée pour la détection de H. pylori et les tests de résistance aux médicaments est très importante pour éradiquer efficacement H. pylori dans la pratique clinique. Ce protocole vise à présenter une procédure spécifique impliquant le test de corde en combinaison avec la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) pour la détection rapide de l’infection à H. pylori et de la résistance aux antibiotiques. Contrairement aux cultures bactériennes, cette méthode permet un diagnostic facile, rapide et non invasif de l’état d’infection à H. pylori et de la résistance aux médicaments. Plus précisément, nous avons utilisé la qPCR pour détecter rea pour l’infection à H. pylori et les mutations dans les gènes de l’ARNr 23S et du gyrA, qui codent respectivement pour la résistance à la clarithromycine et à la lévofloxacine. Comparé aux techniques de culture couramment utilisées, ce protocole fournit une technique non invasive, peu coûteuse et rapide pour détecter l’infection à H. pylori et déterminer sa résistance aux antibiotiques à l’aide de la qPCR.
Introduction
H. pylori est une bactérie à Gram négatif en forme de spirale, très mobile, qui vit principalement dans la région du pylore de l’estomac1. C’est un agent pathogène commun qui infecte près de 50% de la population mondiale2. La plupart des personnes atteintes d’une infection à H. pylori n’ont pas de manifestations cliniques et la plupart développent différentes maladies après plusieurs années d’infection, notamment une gastrite chronique, des ulcères gastroduodénaux, des ulcères gastriques et un cancer gastrique3. Dans plusieurs études basées sur différentes populations, l’efficacité de l’élimination de H. pylori pour prévenir le cancer de l’estomac et les lésions précancéreuses a été démontrée 4,5. Par conséquent, le Centre international de recherche sur le cancer de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) a conseillé l’éradication de H. pylori à titre préventif6.
L’utilisation de méthodes non invasives pour identifier l’infection à H. pylori est un élément clé du traitement pour la plupart des personnes atteintes de dyspepsie asymptomatique. Le test respiratoire à l’urée (UBT), le test d’antigène fécal (SAT) de H. pylori et les tests sérologiques sont des techniques non invasives populaires. Parmi celles-ci, l’UBT est la procédure la moins intrusive et la plus précise disponible. UBT utilise l’uréase, abondamment présente dans H. pylori, pour hydrolyser l’urée marquée isotopiquement en ammoniac et dioxyde de carbone (13C ou 14C). En revanche, le test immunochromatographique (ICA)7 est pratique, simple et non invasif pour l’échantillonnage. Cependant, la précision du test est affectée par plusieurs facteurs, tels que la qualité de l’échantillon de selles, la température et l’intervalle entre le prélèvement de l’échantillon et l’analyse. Un autre test basé sur la réponse immunitaire est le test d’anticorps sériques H. pylori , qui détecte les anticorps dans le sérum d’un patient. Cependant, ce test n’est pas adapté à l’analyse post-traitement car les anticorps restent longtemps après que les bactéries ont été éliminées8. Un autre inconvénient majeur est que ces méthodes ne diagnostiquent que l’infection à H. pylori et ne permettent pas de tests de résistance aux médicaments pour guider le traitement basé sur la sensibilité.
Pour les méthodes de test invasives, le tissu de biopsie gastrique doit être prélevé par endoscopie, puis soumis à l’histologie, au test rapide de l’uréase et à la culture bactérienne. Ces méthodes de test sont également très limitées en raison de plusieurs facteurs. Actuellement, ces techniques sont limitées aux patients âgés, aux patients à haut risque de maladie précancéreuse ou maligne et aux patients qui ont échoué au traitement de première intention pour le reflux gastro-œsophagien ou l’infection à H. pylori 9. Deuxièmement, en raison des caractéristiques de croissance uniques de H. pylori, le taux de réussite de la culture bactérienne n’atteint que 50%10. Ainsi, les méthodes de détection moléculaire offrent un nouvel espoir pour surmonter les exigences élevées des méthodes de détection invasives et guider le traitement basé sur la sensibilité. Parmi les méthodes de détection moléculaire, la PCR quantitative a énormément évolué ces dernières années. La qPCR, contrairement à la PCR traditionnelle, ne nécessite pas d’électrophorèse sur gel et quantifie avec précision l’ADN / ARN dans les échantillons en ajoutant des amorces et des sondes au stade du recuit. Les kits qPCR pour la détection de l’infection à H. pylori et de la résistance aux médicaments sont maintenant disponibles dans le commerce. Néanmoins, chaque méthode a ses limites; Par conséquent, le diagnostic clinique et le traitement d’un patient doivent être considérés en conjonction avec ses symptômes, ses signes, ses antécédents, d’autres tests de laboratoire et sa réponse au traitement.
Actuellement, la principale méthode de traitement des infections à H. pylori est la prise d’antibiotiques, mais dernièrement, il devient de plus en plus difficile de traiter ces infections en raison de l’augmentation de la résistance aux antibiotiques. Par la suite, une baisse significative de l’efficacité du traitement de H. pylori a été observée à l’échelle mondiale, faisant de l’éradication de H. pylori un problème majeur de santé publique11.
La clarithromycine et la lévofloxacine sont les deux antibiotiques à large spectre utilisés pour traiter les infections causées par H. pylori, mais plusieurs études ont signalé une résistance généralisée contre ces deux médicaments dans les isolats d’H. pylori. A2143G, A2142G et A2142C sont trois des nombreuses mutations ponctuelles trouvées dans le gène de l’ARNr 23S de 2,9 kb qui entraînent une résistance à la clarithromycine en empêchant le macrolide de se lier. Dans le même temps, les loci de mutation du gène de résistance à la lévofloxacine sont principalement situés dans les six sites de mutation (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) du gène gyrA 12. La découverte de ces mécanismes de résistance basés sur des mutations génétiques a conduit à un changement progressif dans la détection de H. pylori par le biais d’études culturelles vers des tests moléculaires.
Dans l’ensemble, il existe un besoin clinique urgent d’une méthode de diagnostic non invasive, efficace et simultanée pour la détection des infections à H. pylori et de la résistance aux médicaments. Nous avons adopté un test combiné de corde et une méthode qPCR pour surmonter les difficultés d’échantillonnage et atteindre l’objectif de détection simultanée de l’infection à H. pylori et de la résistance aux médicaments à l’aide de différentes sondes d’amorce.
Protocol
Representative Results
Discussion
La détection de H. pylori peut être effectuée à l’aide de méthodes invasives et non invasives13. Les techniques invasives couramment utilisées telles que l’histopathologie, le test rapide de l’uréase, la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et la culture bactérienne nécessitent une endoscopie et une biopsie. Les tests sérologiques, les tests respiratoires à l’urée et les tests immuno-enzymatiques (ELISA) sont recommandés parmi les procédures non invasives<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Sanming Project of Medicine à Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) et la Fondation pour la recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (subvention no 2022A1515220023). Fondation de recherche pour les talents avancés de l’hôpital populaire provincial de Guandong (No. KJ012021097) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81871734, 82072380, 82272423). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
Riferimenti
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
