Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.
Abstract
Die zelluläre Funktion hängt entscheidend vom Stoffwechsel ab, und die Funktion der zugrunde liegenden Stoffwechselnetzwerke kann durch die Messung von niedermolekularen Zwischenprodukten untersucht werden. Um genaue und zuverlässige Messungen des Zellstoffwechsels zu erhalten, insbesondere bei seltenen Zelltypen wie hämatopoetischen Stammzellen, war es jedoch traditionell erforderlich, Zellen von mehreren Tieren zu poolen. Ein Protokoll ermöglicht es Forschern nun, Metaboliten in seltenen Zelltypen mit nur einer Maus pro Probe zu messen und gleichzeitig mehrere Replikate für häufigere Zelltypen zu generieren. Dadurch reduziert sich die Anzahl der Tiere, die für ein bestimmtes Projekt benötigt werden. Das hier vorgestellte Protokoll weist mehrere wesentliche Unterschiede zu herkömmlichen Metabolomik-Protokollen auf, wie z. B. die Verwendung von 5 g/L NaCl als Mantelflüssigkeit, die direkte Sortierung in Acetonitril und die gezielte Quantifizierung unter strenger Verwendung interner Standards, die genauere und umfassendere Messungen des Zellstoffwechsels ermöglichen. Trotz des Zeitaufwands für die Isolierung einzelner Zellen, die Fluoreszenzfärbung und die Sortierung kann das Protokoll die Unterschiede zwischen Zelltypen und medikamentösen Behandlungen weitgehend erhalten.
Introduction
Der Stoffwechsel ist ein essentieller biologischer Prozess, der in allen lebenden Zellen abläuft. Stoffwechselprozesse umfassen ein riesiges Netzwerk biochemischer Reaktionen, die eng reguliert und miteinander verbunden sind und es den Zellen ermöglichen, Energie zu produzieren und essentielle Biomoleküle zu synthetisieren1. Um die Funktion von Stoffwechselnetzwerken zu verstehen, messen Forscher den Gehalt an niedermolekularen Zwischenprodukten in Zellen. Diese Zwischenprodukte dienen als wichtige Indikatoren für die Stoffwechselaktivität und können wichtige Erkenntnisse über die Zellfunktion liefern.
Die Massenspektrometrie (MS) ist die beliebteste Wahl für den spezifischen Nachweis von Metaboliten in komplexen Proben 1,2. Die Kernspinresonanz (NMR) hat Vorteile bei der absoluten Quantifizierung von Verbindungen und der Strukturaufklärung, aber die MS kann oft mehr Komponenten in komplexen Gemischen wie Bioflüssigkeiten oder Zellextrakten auflösen. In den meisten Fällen wird MS mit einer vorherigen Trennung der Verbindung durch Kapillarelektrophorese (CE), Gaschromatographie (GC) oder Flüssigkeitschromatographie (LC) kombiniert3. Die Wahl der Trennplattform hängt hauptsächlich von der Bandbreite der Zielmetaboliten und der Art der Probe sowie in einer realen Umgebung von der Verfügbarkeit von Maschinen und Fachwissen ab. Alle drei Trennplattformen haben ein breites und sich überschneidendes Spektrum geeigneter Metaboliten, aber unterschiedliche Einschränkungen. Kurz gesagt, CE kann nur geladene Moleküle trennen und erfordert viel Fachwissen, um eine robuste Analyse einer großen Anzahl von Proben durchzuführen4. GC ist auf Moleküle beschränkt, die klein und apolar genug sind, um zu verdampfen, bevor sie sich zersetzen3. Unter Berücksichtigung aller kommerziell erhältlichen LC-Säulen können zwei beliebige Metaboliten durch diese Technologie getrennt werden5. Viele LC-Methoden weisen jedoch ein geringeres Auflösungsvermögen auf als CE- oder GC-Methoden ähnlicher Länge.
Die typische Menge an Ausgangsmaterial für Metabolomics-Messungen liegt in der Regel im Bereich von 5 x 105 bis 5 x 107 Zellen pro Probe, 5-50 mg Nassgewebe oder 5-50 μl Körperflüssigkeit6. Bei der Arbeit mit Primärzellen seltener Zelltypen, wie z.B. hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) oder zirkulierenden Tumorzellen, kann es jedoch schwierig sein, solche Mengen an Ausgangsmaterial zu erhalten. Diese Zellen sind oft in sehr geringer Anzahl vorhanden und können nicht kultiviert werden, ohne kritische zelluläre Eigenschaften zu beeinträchtigen.
HSCs und multipotente Vorläuferzellen (MPPs) sind die am wenigsten differenzierten Zellen des hämatopoetischen Systems und produzieren während des gesamten Lebens eines Organismus kontinuierlich neue Blutzellen. Die Regulation der Hämatopoese ist bei Erkrankungen wie Leukämie und Anämie von klinischer Relevanz. Trotz ihrer Bedeutung gehören HSCs und MPPs zu den seltensten Zellen innerhalb des hämatopoetischen Systems. Aus einer einzigen Maus können typischerweise etwa 5000 HSCs isoliert werden 7,8,9. Da herkömmliche Metabolomics-Methoden mehr Eingangsmaterial benötigen, war es oft notwendig, Zellen von mehreren Mäusen zu poolen, um seltene Zelltypen zu analysieren10,11.
Ziel war es, ein Protokoll zu entwickeln, das die Messung von Metaboliten in nur 5000 Zellen pro Probe ermöglicht, um die Generierung von Metabolomics-Daten aus den HSCs einer einzelnen Maus zu ermöglichen12. Gleichzeitig ermöglicht diese Methode die Generierung mehrerer Replikate aus einer einzigen Maus für häufigere Zelltypen wie Lymphozyten. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der Tiere, die für ein bestimmtes Projekt benötigt werden, und trägt so zur “3R” (Reduction, Replacement, Refinement) von Tierversuchen bei.
Metaboliten in Zellen können sehr hohe Umsatzraten aufweisen, oft in der Größenordnung von Sekunden13. Die Vorbereitung der Proben für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kann jedoch Stunden dauern, und die FACS-Sortierung selbst kann Minuten bis Stunden dauern, was zu möglichen Veränderungen des Metaboloms aufgrund nicht-physiologischer Bedingungen führt. Einige der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien (z. B. Ammoniumchlorid-Kalium-[ACK]-Lysepuffer) können ähnliche Wirkungen haben. Diese Bedingungen können zellulären Stress verursachen und die Konzentrationen und Verhältnisse von Metaboliten in den Zellen beeinflussen, was zu ungenauen oder verzerrten Messungen des Zellstoffwechsels führt 14,15,16. Die metabolischen Veränderungen durch die Probenvorbereitung werden manchmal auch als Sortierartefakte bezeichnet. Lange Verdauungsprotokolle und scharfe Reagenzien, die zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus hartem oder zähem Gewebe erforderlich sein können, können dieses Problem verschlimmern. Welche Veränderungen auftreten können, hängt wahrscheinlich vom Zelltyp und den Verarbeitungsbedingungen ab. Die genaue Art der Veränderungen ist noch unbekannt, da der Stoffwechselzustand der ungestörten Zellen im lebenden Gewebe nicht gemessen werden kann.
Das hier vorgestellte Protokoll weist mehrere wesentliche Unterschiede im Vergleich zu herkömmlichen Methoden auf, nämlich die Verwendung von 5 g/L NaCl als Mantelflüssigkeit, die Sortierung direkt in den Extraktionspuffer, die Injektion großer Probenvolumina bei der hydrophilen Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HILIC-MS) und die Verwendung einer gezielten Quantifizierung, die rigorose Verwendung interner Standards und Hintergrundkontrollen (Abbildung 1). Dieses Protokoll hat das Potenzial, Unterschiede zwischen Zelltypen und zwischen medikamentöser Behandlung und Vehikelkontrolle weitgehend zu erhalten12. Selbst für kultivierte Zellen ist es im Vergleich zu alternativen Ansätzen, wie der etablierteren Zentrifugation und der manuellen Entfernung des Überstandes, günstig. Da es jedoch immer noch zu Sortierartefakten kommen kann, müssen die Daten mit Vorsicht interpretiert werden. Trotz dieser Einschränkung stellt das Protokoll eine signifikante Verbesserung auf dem Gebiet der metabolischen Profilerstellung dar und ermöglicht genauere und umfassendere Messungen des Zellstoffwechsels in seltenen Primärzellen12.
Die Fähigkeit, breite Stoffwechselprofile in seltenen Primärzellen robust zu messen, öffnet die Tür zu neuen Experimenten in der biomedizinischen Forschung mit diesen Zellen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die metabolisch vermittelte Regulation in HSCs die Selbsterneuerungsfähigkeit der Dormanz beeinflusst, mit Auswirkungen auf Anämie und Leukämie11,17. In zirkulierenden Tumorzellen von Patienten wurden Unterschiede in der Expression von Stoffwechselgenen zwischen Tumor und benachbarten Zellen gezeigt18,19. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern nun, diese Unterschiede systematisch auf metabolischer Ebene zu untersuchen, die im Allgemeinen als näher am zellulären Phänotyp als an der Genexpression angesehen wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Implementierung einer gezielten Metabolomik mit diesem Protokoll sind 1) eine robuste Färbe- und Gating-Strategie, die saubere Zellpopulationen liefert, 2) eine präzise Handhabung von Flüssigkeitsvolumina, 3) ein reproduzierbares Timing aller experimentellen Schritte, insbesondere aller Schritte vor der Metabolitenextraktion. Im Idealfall sollten alle Proben, die zu einem Experiment gehören, in einem Batch verarbeitet und gemessen werden, um Batch-Effekte zu minimieren<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Tiereinrichtung des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie und Epigenetik für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Tiere.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
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