Metabolomica mirata su cellule primarie rare
Summary
Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.
Abstract
La funzione cellulare dipende in modo critico dal metabolismo e la funzione delle reti metaboliche sottostanti può essere studiata misurando gli intermedi di piccole molecole. Tuttavia, l’ottenimento di misurazioni accurate e affidabili del metabolismo cellulare, in particolare in tipi di cellule rare come le cellule staminali ematopoietiche, ha tradizionalmente richiesto il raggruppamento di cellule provenienti da più animali. Un protocollo consente ora ai ricercatori di misurare i metaboliti in tipi di cellule rare utilizzando un solo topo per campione, generando al contempo più repliche per tipi di cellule più abbondanti. In questo modo si riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto. Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai protocolli metabolomici tradizionali, come l’utilizzo di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto in acetonitrile e l’utilizzo di una quantificazione mirata con un uso rigoroso di standard interni, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare. Nonostante il tempo necessario per l’isolamento delle singole cellule, la colorazione fluorescente e lo smistamento, il protocollo può preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e i trattamenti farmacologici.
Introduction
Il metabolismo è un processo biologico essenziale che si verifica in tutte le cellule viventi. I processi metabolici coinvolgono una vasta rete di reazioni biochimiche strettamente regolate e interconnesse, consentendo alle cellule di produrre energia e sintetizzare biomolecole essenziali1. Per comprendere la funzione delle reti metaboliche, i ricercatori misurano i livelli di piccole molecole intermedie all’interno delle cellule. Questi intermedi fungono da importanti indicatori dell’attività metabolica e possono rivelare informazioni critiche sulla funzione cellulare.
La spettrometria di massa (MS) è la scelta più popolare per la rilevazione specifica di metaboliti in campioni complessi 1,2. La risonanza magnetica nucleare (NMR) presenta vantaggi nella quantificazione assoluta dei composti e nella delucidazione della struttura, ma la MS può spesso risolvere più componenti in miscele complesse come biofluidi o estratti cellulari. Il più delle volte, la MS è combinata con la separazione preventiva del composto mediante elettroforesi capillare (CE), gascromatografia (GC) o cromatografia liquida (LC)3. La scelta della piattaforma di separazione è guidata principalmente dalla gamma di metaboliti target e dal tipo di campione e, in un contesto reale, dalla disponibilità di macchine e competenze. Tutte e tre le piattaforme di separazione hanno una gamma ampia e sovrapposta di metaboliti adatti, ma limitazioni diverse. In breve, la CE può solo separare le molecole cariche e richiede molta esperienza per implementare un’analisi robusta di un gran numero di campioni4. La GC è limitata alle molecole che sono abbastanza piccole e apolari da evaporare prima di decomporsi3. Considerando tutte le colonne LC disponibili in commercio, due metaboliti qualsiasi possono essere separati con questa tecnologia5. Tuttavia, molti metodi LC mostrano un potere risolutivo inferiore rispetto ai metodi CE o GC di lunghezza simile.
La quantità tipica di materiale di partenza per le misurazioni metabolomiche è solitamente compresa tra 5 x 10e 5 x 107 cellule per campione, 5-50 mg di tessuto umido o 5-50 μL di fluido corporeo6. Tuttavia, può essere difficile ottenere tali quantità di materiale di partenza quando si lavora con cellule primarie di tipi di cellule rare, come ad esempio le cellule staminali ematopoietiche (HSC) o le cellule tumorali circolanti. Queste cellule sono spesso presenti in numero molto basso e non possono essere coltivate senza compromettere le caratteristiche cellulari critiche.
Le HSC e le cellule progenitrici multipotenti (MPP) sono le cellule meno differenziate del sistema ematopoietico e producono continuamente nuove cellule del sangue per tutta la vita di un organismo. La regolazione dell’emopoiesi è di rilevanza clinica in condizioni come la leucemia e l’anemia. Nonostante la loro importanza, le HSC e le MPP sono tra le cellule più rare all’interno del sistema ematopoietico. Da un singolo topo, tipicamente, si possono isolare circa 5000 HSC 7,8,9. Poiché i metodi metabolomici tradizionali richiedono più materiale di input, è stato spesso necessario raggruppare le cellule di più topi per analizzare i tipi di cellule rare10,11.
Qui, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo che consenta la misurazione dei metaboliti in appena 5000 cellule per campione per consentire la generazione di dati metabolomici dalle HSC di un singolo topo12. Allo stesso tempo, questo metodo consente di generare più repliche da un singolo topo per tipi di cellule più abbondanti come i linfociti. Questo approccio riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto, contribuendo così alle “3R” (riduzione, sostituzione, perfezionamento) degli esperimenti sugli animali.
I metaboliti nelle cellule possono avere tassi di turnover molto elevati, spesso nell’ordine dei secondi13. Tuttavia, la preparazione dei campioni per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) può richiedere ore e lo smistamento FACS stesso può richiedere da minuti a ore, portando a potenziali alterazioni del metaboloma a causa di condizioni non fisiologiche. Alcuni dei reagenti utilizzati in questo protocollo (come il tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio [ACK]) possono avere effetti simili. Queste condizioni possono causare stress cellulare e avere un impatto sui livelli e sui rapporti dei metaboliti all’interno delle cellule, portando a misurazioni imprecise o distorte del metabolismo cellulare 14,15,16. I cambiamenti metabolici dovuti alla preparazione del campione sono talvolta indicati come artefatti di smistamento. I lunghi protocolli di digestione e i reagenti aggressivi che potrebbero essere necessari per produrre sospensioni unicellulari da tessuti duri o duri possono aggravare questo problema. I cambiamenti che possono verificarsi dipendono probabilmente dal tipo di cellula e dalle condizioni di elaborazione. La natura precisa dei cambiamenti rimane sconosciuta, poiché lo stato metabolico delle cellule indisturbate nel tessuto vivente non può essere misurato.
Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai metodi tradizionali, vale a dire l’uso di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto nel tampone di estrazione, l’iniezione di grandi volumi di campione sull’interazione idrofila cromatografia liquida-spettrometria di massa (HILIC-MS) e l’utilizzo di una quantificazione mirata, l’uso rigoroso di standard interni e controlli di fondo (Figura 1). Questo protocollo ha il potenziale per preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e tra il trattamento farmacologico e il controllo del veicolo12. Anche per le cellule in coltura, si confronta favorevolmente con approcci alternativi, come la centrifugazione più consolidata e la rimozione manuale del surnatante. Tuttavia, poiché gli artefatti di ordinamento possono ancora verificarsi, i dati devono essere interpretati con cautela. Nonostante questa limitazione, il protocollo rappresenta un miglioramento significativo nel campo della profilazione metabolica, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare in cellule primarie rare12.
La capacità di misurare in modo robusto ampi profili metabolici in cellule primarie rare apre la porta a nuovi esperimenti di ricerca biomedica che coinvolgono queste cellule. Ad esempio, è stato dimostrato che la regolazione metabolicamente mediata nelle HSC ha un impatto sulla capacità di auto-rinnovamento della dormienza, con implicazioni per l’anemia e la leucemia11,17. Nelle cellule tumorali circolanti derivate da pazienti, sono state dimostrate differenze nell’espressione dei geni metabolici tra il tumore e le cellule adiacenti18,19. Questo protocollo consente ora ai ricercatori di studiare sistematicamente queste differenze a livello metabolico, che è generalmente considerato più vicino al fenotipo cellulare che all’espressione genica.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per un’implementazione di successo della metabolomica mirata utilizzando questo protocollo sono 1) una robusta strategia di colorazione e gating che produrrà popolazioni cellulari pulite 2) una gestione precisa dei volumi di liquido, 3) una tempistica riproducibile di tutte le fasi sperimentali, in particolare tutte le fasi precedenti all’estrazione del metabolita. Idealmente, tutti i campioni appartenenti a un esperimento dovrebbero essere processati e misurati in un lotto per ridurre al minimo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la struttura animale del Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics per aver fornito gli animali utilizzati in questo studio.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
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