希少初代細胞のターゲットメタボロミクス
Summary
ここでは、希少な細胞タイプの代謝物を正確かつ確実に測定するためのプロトコルを紹介します。細胞選別用の改良シース液や関連するブランクサンプルの生成などの技術的改善により、サンプルあたりわずか5000細胞のインプットで代謝物の包括的な定量が可能になりました。
Abstract
細胞機能は代謝に大きく依存しており、その根底にある代謝ネットワークの機能は、低分子中間体を測定することで研究することができます。しかし、特に造血幹細胞のような希少な細胞種において、細胞代謝の正確で信頼性の高い測定値を得るには、従来、複数の動物の細胞をプールする必要がありました。プロトコルにより、研究者は、サンプルごとに1つのマウスのみを使用して希少な細胞タイプの代謝物を測定し、より豊富な細胞タイプに対して複数の複製を生成することができます。これにより、特定のプロジェクトに必要な動物の数が減ります。ここで紹介するプロトコールには、5 g/L NaClをシース液として使用する、アセトニトリルに直接選別する、内部標準を厳密に使用してターゲット定量を利用するなど、従来のメタボロミクスプロトコルとはいくつかの重要な違いがあり、細胞代謝のより正確で包括的な測定を可能にします。単一細胞の単離、蛍光染色、選別に時間がかかるにもかかわらず、このプロトコルは細胞タイプ間および薬物治療の違いを大幅に保持することができます。
Introduction
代謝は、すべての生細胞で発生する重要な生物学的プロセスです。代謝プロセスには、緊密に制御され相互接続された生化学反応の広大なネットワークが含まれており、細胞がエネルギーを生成し、必須の生体分子を合成することを可能にします1。代謝ネットワークの機能を理解するために、研究者は細胞内の低分子中間体のレベルを測定します。これらの中間体は、代謝活性の重要な指標として機能し、細胞機能に関する重要な洞察を明らかにすることができます。
質量分析(MS)は、複雑なサンプル中の代謝物を特異的に検出するための最も一般的な選択肢です1,2。核磁気共鳴(NMR)は、化合物の絶対定量や構造解明に有利ですが、多くの場合、MSは生体液や細胞抽出物などの複雑な混合物中のより多くの成分を分離できます。多くの場合、MSは、キャピラリー電気泳動(CE)、ガスクロマトグラフィー(GC)、または液体クロマトグラフィー(LC)による化合物の事前分離と組み合わされます3。分離プラットホームの選択は、主にターゲット代謝物の範囲とサンプルの種類によって左右され、実際の環境では、機械と専門知識の可用性によって決まります。3つの分離プラットホームはすべて、適切な代謝産物の範囲が広く重複していますが、制限は異なります。簡単に言うと、CEは荷電した分子しか分離できず、多数のサンプルの堅牢な分析を実施するには多くの専門知識が必要です4。GCは、分解する前に蒸発するのに十分なほど小さく、無極性の分子に限定されます3。市販されているすべてのLCカラムを考慮すると、この技術によって任意の2つの代謝物を分離することができます5。ただし、多くの LC 分析法は、同程度の長さの CE 分析法や GC 分析法よりも分離能が低くなります。
メタボロミクス測定のための出発物質の典型的な量は、通常、サンプルあたり5×105 〜5×107 細胞、5〜50mgの湿潤組織、または5〜50μLの体液の範囲である6。しかし、造血幹細胞(HSC)や循環腫瘍細胞など、希少細胞タイプの初代細胞を扱う場合、このような量の出発物質を得ることは困難な場合があります。これらの細胞は、多くの場合、非常に少ない数しか存在せず、重要な細胞の特徴を損なうことなく培養することはできません。
造血幹細胞と多能性前駆細胞(MPP)は、造血系の中で最も分化の少ない細胞であり、生物の生涯を通じて継続的に新しい血液細胞を産生します。造血の調節は、白血病や貧血などの状態において臨床的に関連性があります。その重要性にもかかわらず、造血幹細胞とMPPは造血系内で最も希少な細胞の一つです。1匹のマウスから、典型的には、約5000個のHSCを単離することができる7,8,9。従来のメタボロミクス法ではより多くのインプット材料を必要とするため、希少な細胞タイプを解析するには、複数のマウスの細胞をプールすることが必要になることがよくありました10,11。
ここでは、1匹のマウスの造血幹細胞からメタボロミクスデータを生成できるように、1サンプルあたりわずか5000細胞の代謝物を測定できるプロトコルの開発を目指しました12。同時に、この方法では、リンパ球などのより豊富な細胞タイプに対して、1匹のマウスから複数の複製を生成することができます。このアプローチは、プロジェクトに必要な動物の数を減らし、動物実験の「3R(削減、代替、精緻化)」に貢献します。
細胞内の代謝産物は非常に高い代謝回転率を持つことがあり、多くの場合、秒単位です13。しかし、蛍光活性化細胞選別(FACS)用のサンプルの調製には数時間かかることがあり、FACSの選別自体には数分から数時間かかることがあり、非生理学的条件によるメタボロームの変化につながる可能性があります。このプロトコルで使用される試薬の一部(アンモニウム-塩化物-カリウム[ACK]溶解緩衝液など)は、同様の効果をもたらす可能性があります。これらの状態は細胞ストレスを引き起こし、細胞内の代謝産物のレベルと比率に影響を与える可能性があり、細胞代謝の不正確または偏った測定につながる可能性があります14,15,16。サンプル調製による代謝の変化は、ソーティングアーチファクトと呼ばれることもあります。硬組織または硬い組織から単一細胞懸濁液を産生するために必要となる可能性のある長時間の消化プロトコルと過酷な試薬は、この問題を悪化させる可能性があります。どのような変化が起こり得るかは、細胞の種類や処理条件によって異なる可能性があります。生体組織内の乱れていない細胞の代謝状態を測定できないため、変化の正確な性質は不明のままです。
ここで紹介するプロトコールには、従来の方法と比較していくつかの重要な違いがあり、すなわち、シース液として 5 g/L NaCl を使用すること、抽出バッファーに直接選別すること、親水性相互作用液体クロマトグラフィー質量分析(HILIC-MS)で大量のサンプルを注入すること、ターゲット定量、内部標準の厳密な使用、およびバックグラウンドコントロールを利用すること(図 1)).このプロトコルは、細胞タイプ間および薬物治療と車両制御の違いを大幅に維持する可能性を秘めています12。培養細胞の場合でも、より確立された遠心分離や上清の手動除去などの代替アプローチと比較しても遜色ありません。ただし、並べ替えアーティファクトが発生する可能性があるため、データの解釈には注意が必要です。この制限にもかかわらず、プロトコルは新陳代謝の図表を描くことの分野の重要な改善を表し、まれな初代細胞の細胞新陳代謝のより正確で、広範囲の測定を可能にする12。
希少な初代細胞の幅広い代謝プロファイルを頑健に測定できることで、これらの細胞を含む生物医学研究における新しい実験への扉が開かれます。例えば、造血幹細胞における代謝媒介性調節は、休眠期の自己複製能力に影響を与えることが示されており、貧血や白血病にも影響します11,17。患者由来の循環腫瘍細胞では、腫瘍と隣接細胞との間の代謝遺伝子の発現の違いが示されています18,19。このプロトコルは研究者が遺伝子発現より細胞表現型に近いと一般にみなされる新陳代謝のレベルでこれらの相違を組織的に調査することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルを使用してターゲットメタボロミクスを成功裏に実施するための最も重要なステップは、1)クリーンな細胞集団をもたらす堅牢な染色およびゲーティング戦略、2)液体量の正確な取り扱い、3)すべての実験ステップ、特に代謝物抽出前のすべてのステップの再現性のあるタイミングです。理想的には、1つの実験に属するすべてのサンプルを1つのバッチで処理および測定して、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究で使用した動物を提供してくれたマックス・プランク免疫生物学・エピジェネティクス研究所の動物施設に感謝します。
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
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