희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학
Summary
여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.
Abstract
세포 기능은 신진대사에 결정적으로 의존하며, 저분자 중간체를 측정하여 기본 대사 네트워크의 기능을 연구할 수 있습니다. 그러나 특히 조혈모세포와 같은 희귀 세포 유형에서 세포 대사를 정확하고 신뢰할 수 있는 측정값으로 얻으려면 전통적으로 여러 동물의 세포를 통합해야 했습니다. 이제 프로토콜에 따라 연구자들은 샘플당 하나의 마우스만 사용하여 희귀 세포 유형의 대사 산물을 측정하는 동시에 더 풍부한 세포 유형에 대한 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이렇게 하면 지정된 프로젝트에 필요한 동물의 수가 줄어듭니다. 여기에 제시된 프로토콜은 5g/L NaCl을 외피 유체로 사용하고, 아세토니트릴로 직접 분류하고, 내부 표준물질을 엄격하게 사용하여 표적 정량을 활용하는 등 기존 대사체학 프로토콜에 비해 몇 가지 주요 차이점을 포함하고 있어 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있습니다. 단일 세포의 분리, 형광 염색 및 분류에 필요한 시간에도 불구하고 프로토콜은 세포 유형 및 약물 처리 간의 차이를 상당 부분 보존할 수 있습니다.
Introduction
신진대사는 모든 살아있는 세포에서 발생하는 필수적인 생물학적 과정입니다. 대사 과정에는 밀접하게 조절되고 상호 연결된 방대한 생화학 반응 네트워크가 포함되며, 이를 통해 세포는 에너지를 생산하고 필수 생체 분자를 합성할 수 있습니다1. 대사 네트워크의 기능을 이해하기 위해 연구자들은 세포 내 저분자 중간체의 수준을 측정합니다. 이러한 중간체는 대사 활동의 중요한 지표 역할을 하며 세포 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
질량분석법(MS)은 복잡한 시료 1,2에서 대사 산물의 특이적 검출을 위해 가장 널리 사용되는 선택입니다. 핵 자기 공명(NMR)은 화합물의 절대 정량화 및 구조 규명에 장점이 있지만, MS는 종종 생체 유체 또는 세포 추출물과 같은 복잡한 혼합물에서 더 많은 성분을 분해할 수 있습니다. MS는 모세관 전기영동(CE), 가스 크로마토그래피(GC) 또는 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 화합물의 사전 분리와 결합되는 경우가 많습니다3. 분리 플랫폼의 선택은 대부분 표적 대사 산물의 범위와 시료 유형에 따라 결정되며, 실제 환경에서는 기계 및 전문 지식의 가용성에 따라 결정됩니다. 세 가지 분리 플랫폼 모두 광범위하고 겹치는 범위의 적합한 대사 산물을 가지고 있지만 한계는 다릅니다. 간단히 말해서, CE는 하전 분자만 분리할 수 있으며 많은 수의 샘플에 대한 강력한 분석을 구현하려면 많은 전문 지식이 필요합니다4. GC는 분해되기 전에 증발할 수 있을 만큼 작고 무극성인 분자로 제한됩니다3. 상업적으로 이용 가능한 모든 LC 컬럼을 고려할 때, 임의의 두 대사 산물은 이 기술로 분리될 수 있다5. 그러나 많은 LC 분석법은 길이가 비슷한 CE 또는 GC 분석법보다 분해능이 떨어집니다.
대사체학 측정을 위한 출발 물질의 일반적인 양은 일반적으로 샘플당 5 x 105 내지 5 x 107 세포, 5-50 mg의 습윤 조직 또는 5-50 μL의 체액6 범위이다. 그러나 조혈모세포(HSC) 또는 순환 종양 세포와 같은 희귀 세포 유형의 일차 세포를 다룰 때 이러한 양의 시작 물질을 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 세포는 종종 매우 적은 수로 존재하며 중요한 세포 기능을 손상시키지 않고는 배양할 수 없습니다.
HSC와 다분화능 전구세포(MPP)는 조혈계에서 가장 분화가 적은 세포이며 유기체의 일생 동안 지속적으로 새로운 혈액 세포를 생성합니다. 조혈의 조절은 백혈병 및 빈혈과 같은 상태에서 임상적으로 관련이 있습니다. 그 중요성에도 불구하고 HSC와 MPP는 조혈계 내에서 가장 희귀한 세포 중 하나입니다. 단일 마우스에서 일반적으로 약 5000개의 HSC를 분리할 수 있습니다 7,8,9. 전통적인 대사체학 방법은 더 많은 투입 물질을 필요로 하기 때문에 희귀 세포 유형을 분석하기 위해 여러 마우스의 세포를 풀링하는 것이 종종 필요했습니다10,11.
여기에서, 우리는 단일 마우스(12)의 HSC로부터 대사체학 데이터를 생성할 수 있도록 샘플당 5000개 세포만큼 작은 세포에서 대사체의 측정을 가능하게 하는 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 동시에 이 방법을 사용하면 림프구와 같은 더 풍부한 세포 유형에 대해 단일 마우스에서 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이 접근 방식은 주어진 프로젝트에 필요한 동물의 수를 줄여 동물 실험의 “3R”(축소, 대체, 개선)에 기여합니다.
세포의 대사 산물은 종종 초13 정도로 매우 높은 회전율을 가질 수 있습니다. 그러나 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 시료 준비는 몇 시간이 걸릴 수 있으며, FACS 분류 자체는 몇 분에서 몇 시간이 걸릴 수 있으므로 비생리학적 조건으로 인해 대사체에 잠재적인 변화가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 일부 시약(예: 암모늄-클로라이드-칼륨[ACK] 용해 완충액)은 유사한 효과를 가질 수 있습니다. 이러한 조건은 세포 스트레스를 유발하고 세포 내 대사 산물의 수준과 비율에 영향을 미쳐 세포 대사의 부정확하거나 편향된 측정으로 이어질 수 있습니다 14,15,16. 시료 전처리로 인한 대사 변화는 때때로 분류 아티팩트(sorting artifact)라고 합니다. 단단하거나 질긴 조직에서 단세포 현탁액을 생성하는 데 필요할 수 있는 긴 분해 프로토콜과 가혹한 시약은 이 문제를 악화시킬 수 있습니다. 발생할 수 있는 변화는 셀 유형 및 처리 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 변화의 정확한 성질은 살아있는 조직에서 방해받지 않은 세포의 대사 상태를 측정할 수 없기 때문에 알려지지 않았습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 기존 방법과 비교하여 몇 가지 주요 차이점, 즉 5g/L NaCl을 피복 유체로 사용, 추출 완충액으로 직접 분류, 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피-질량분석법(HILIC-MS)에 대량의 시료 주입, 표적 정량 활용, 내부 표준물질 및 백그라운드 제어의 엄격한 사용(그림 1)). 이 프로토콜은 세포 유형 간, 그리고 약물 처리와 차량 제어 사이의 차이를 상당 부분 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있다12. 배양된 세포의 경우에도 보다 확립된 원심분리 및 상층액의 수동 제거와 같은 대체 접근 방식과 유리하게 비교됩니다. 그러나 정렬 아티팩트가 계속 발생할 수 있으므로 데이터를 주의해서 해석해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 프로토콜은 대사 프로파일링 분야에서 상당한 개선을 나타내며, 희귀 일차 세포에서 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있게 한다12.
희귀 일차 세포에서 광범위한 대사 프로파일을 강력하게 측정할 수 있는 능력은 이러한 세포와 관련된 생물 의학 연구의 새로운 실험의 문을 열어줍니다. 예를 들어, HSC의 대사 매개 조절은 빈혈 및 백혈병에 대한 영향과 함께 휴면 자가 재생 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다11,17. 환자 유래 순환 종양 세포에서 종양과 인접 세포 간의 대사 유전자 발현의 차이가18,19로 나타났습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 일반적으로 유전자 발현보다 세포 표현형에 더 가까운 것으로 간주되는 대사 수준에서 이러한 차이를 체계적으로 연구할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜을 사용하여 표적 대사체학을 성공적으로 구현하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 깨끗한 세포 집단을 산출하는 강력한 염색 및 게이팅 전략, 2) 액체 부피의 정확한 처리, 3) 모든 실험 단계, 특히 대사체 추출 전 모든 단계의 재현 가능한 타이밍입니다. 이상적으로는, 하나의 실험에 속하는 모든 샘플은 배치 효과를 최소화하기 위해 하나의 배치로 처리되고 측정되어야 한다…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 연구에 사용된 동물을 제공한 막스 플랑크 면역생물학 및 후성유전학 연구소(Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics)의 동물 시설에 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
