Metabolômica direcionada em células primárias raras
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para medir metabólitos de forma precisa e confiável em tipos celulares raros. Melhorias técnicas, incluindo um fluido de bainha modificado para a triagem celular e a geração de amostras em branco relevantes, permitem uma quantificação abrangente de metabolitos com uma entrada de apenas 5000 células por amostra.
Abstract
A função celular depende criticamente do metabolismo, e a função das redes metabólicas subjacentes pode ser estudada medindo pequenos intermediários de moléculas. No entanto, a obtenção de medidas precisas e confiáveis do metabolismo celular, particularmente em tipos raros de células, como células-tronco hematopoéticas, tradicionalmente requer o agrupamento de células de vários animais. Um protocolo agora permite que os pesquisadores meçam metabólitos em tipos raros de células usando apenas um camundongo por amostra, enquanto geram várias réplicas para tipos de células mais abundantes. Isso reduz o número de animais necessários para um determinado projeto. O protocolo aqui apresentado envolve várias diferenças importantes em relação aos protocolos metabolômicos tradicionais, tais como o uso de NaCl 5 g/L como fluido de bainha, a classificação direta em acetonitrila e a utilização de quantificação direcionada com uso rigoroso de padrões internos, permitindo medidas mais precisas e abrangentes do metabolismo celular. Apesar do tempo necessário para o isolamento de células únicas, coloração fluorescente e classificação, o protocolo pode preservar as diferenças entre os tipos celulares e tratamentos medicamentosos em grande medida.
Introduction
O metabolismo é um processo biológico essencial que ocorre em todas as células vivas. Os processos metabólicos envolvem uma vasta rede de reações bioquímicas que são fortemente reguladas e interligadas, permitindo que as células produzam energia e sintetizem biomoléculas essenciais1. Para entender a função das redes metabólicas, os pesquisadores medem os níveis de pequenas moléculas intermediárias dentro das células. Esses intermediários servem como importantes indicadores da atividade metabólica e podem revelar insights críticos sobre a função celular.
A espectrometria de massas (EM) é a escolha mais popular para a detecção específica de metabólitos em amostras complexas 1,2. A ressonância magnética nuclear (RMN) tem vantagens na quantificação absoluta de compostos e na elucidação da estrutura, mas a EM pode frequentemente resolver mais componentes em misturas complexas, como biofluidos ou extratos celulares. Na maioria das vezes, a EM é combinada com a separação prévia do composto por eletroforese capilar (CE), cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida (LC)3. A escolha da plataforma de separação é impulsionada principalmente pela gama de metabólitos alvo e pelo tipo de amostra e, em um cenário do mundo real, pela disponibilidade de máquinas e experiência. Todas as três plataformas de separação têm uma ampla e sobreposta gama de metabólitos adequados, mas limitações diferentes. Resumidamente, a CE só pode separar moléculas carregadas e requer muita experiência para implementar análises robustas de um grande número de amostras4. O CG é limitado a moléculas pequenas e apolares o suficiente para evaporar antes de se decomporem3. Considerando todas as colunas LC disponíveis comercialmente, quaisquer dois metabólitos podem ser separados por essa tecnologia5. No entanto, muitos métodos LC exibem menor poder de resolução do que os métodos CE ou GC de comprimento semelhante.
A quantidade típica de material de partida para medições metabolômicas está geralmente na faixa de 5 x 105 a 5 x 107 células por amostra, 5-50 mg de tecido úmido ou 5-50 μL de fluido corporal6. No entanto, pode ser um desafio obter tais quantidades de material de partida ao trabalhar com células primárias de tipos celulares raros, como, por exemplo, células-tronco hematopoéticas (CTHs) ou células tumorais circulantes. Essas células estão frequentemente presentes em números muito baixos e não podem ser cultivadas sem comprometer características celulares críticas.
As CTHs e as células progenitoras multipotentes (MPPs) são as células menos diferenciadas do sistema hematopoiético e produzem continuamente novas células sanguíneas ao longo da vida de um organismo. A regulação da hematopoese é de relevância clínica em condições como leucemia e anemia. Apesar de sua importância, as CTHs e MPPs estão entre as células mais raras do sistema hematopoético. De um único camundongo, tipicamente, cerca de 5000 CTHs podem ser isoladas 7,8,9. Como os métodos metabolômicos tradicionais requerem mais material de entrada, o agrupamento de células de múltiplos camundongos foi frequentemente necessário para analisar tipos celulares raros10,11.
Aqui, nosso objetivo foi desenvolver um protocolo que possibilitasse a mensuração de metabólitos em até 5000 células por amostra para possibilitar a geração de dados metabolômicos a partir das CTHs de um únicocamundongo12. Ao mesmo tempo, este método permite gerar múltiplas réplicas a partir de um único rato para tipos celulares mais abundantes, como os linfócitos. Esta abordagem reduz o número de animais necessários para um determinado projeto, contribuindo assim para o “3R” (redução, substituição, refinamento) de experimentos com animais.
Metabólitos em células podem ter taxas de turnover muito altas, muitas vezes da ordem de segundos13. No entanto, o preparo de amostras para a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) pode levar horas, e a própria classificação da FACS pode levar de minutos a horas, levando a possíveis alterações no metaboloma devido a condições não fisiológicas. Alguns dos reagentes usados neste protocolo (como tampão de lise amônio-cloreto de potássio [ACK]) podem ter efeitos semelhantes. Essas condições podem causar estresse celular e afetar os níveis e proporções de metabólitos dentro das células, levando a medidas imprecisas ou enviesadas do metabolismo celular 14,15,16. As alterações metabólicas devidas à preparação da amostra são por vezes referidas como artefatos de triagem. Longos protocolos de digestão e reagentes severos que podem ser necessários para produzir suspensões unicelulares a partir de tecidos duros ou resistentes podem agravar esse problema. As mudanças que podem ocorrer provavelmente dependem do tipo de célula e da condição de processamento. A natureza precisa das alterações permanece desconhecida, uma vez que o estado metabólico das células não perturbadas no tecido vivo não pode ser medido.
O protocolo aqui apresentado envolve várias diferenças importantes em relação aos métodos tradicionais, a saber, o uso de NaCl 5 g/L como fluido de bainha, a classificação diretamente em tampão de extração, a injeção de grandes volumes de amostra em cromatografia líquida-espectrometria de massas de interação hidrofílica (HILIC-MS), e a utilização de quantificação direcionada, uso rigoroso de padrões internos e controles de fundo (Figura 1). Esse protocolo tem o potencial de preservar diferenças entre os tipos celulares e entre o tratamento medicamentoso e o controle do veículo em grande medida12. Mesmo para células cultivadas, compara-se favoravelmente a abordagens alternativas, como a centrifugação mais estabelecida e a remoção manual do sobrenadante. No entanto, como os artefatos de classificação ainda podem ocorrer, os dados devem ser interpretados com cautela. Apesar dessa limitação, o protocolo representa uma melhora significativa no campo do perfil metabólico, permitindo medidas mais precisas e abrangentes do metabolismo celular em células primáriasraras12.
A capacidade de medir de forma robusta perfis metabólicos amplos em células primárias raras abre as portas para novos experimentos em pesquisas biomédicas envolvendo essas células. Por exemplo, foi demonstrado que a regulação metabolicamente mediada em HSCs afeta a capacidade de autorrenovação da dormência, com implicações para anemia e leucemia 11,17. Em células tumorais circulantes derivadas do paciente, diferenças na expressão de genes metabólicos entre células tumorais e adjacentes têm sido demonstradas18,19. Esse protocolo agora permite que os pesquisadores estudem essas diferenças sistematicamente em um nível metabólico, que geralmente é considerado mais próximo do fenótipo celular do que da expressão gênica.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas mais críticas para a implementação bem-sucedida de metabolômica direcionada usando este protocolo são 1) uma estratégia robusta de coloração e fechamento que produzirá populações de células limpas 2) manuseio preciso de volumes de líquidos, 3) tempo reprodutível de todas as etapas experimentais, em particular todas as etapas anteriores à extração do metabólito. Idealmente, todas as amostras pertencentes a um experimento devem ser processadas e medidas em um lote para minimizar os efeitos do lo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao biotério do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética pelo fornecimento dos animais utilizados neste estudo.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
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