Metabolómica dirigida en células primarias raras
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir de manera precisa y confiable los metabolitos en tipos de células raras. Las mejoras técnicas, incluido un fluido de vaina modificado para la clasificación de células y la generación de muestras en blanco relevantes, permiten una cuantificación completa de metabolitos con una entrada de solo 5000 células por muestra.
Abstract
La función celular depende críticamente del metabolismo, y la función de las redes metabólicas subyacentes se puede estudiar midiendo los intermedios de moléculas pequeñas. Sin embargo, la obtención de mediciones precisas y fiables del metabolismo celular, especialmente en tipos de células raras como las células madre hematopoyéticas, ha requerido tradicionalmente la agrupación de células de múltiples animales. Un protocolo ahora permite a los investigadores medir metabolitos en tipos de células raras utilizando solo un ratón por muestra, al tiempo que generan múltiples réplicas para tipos de células más abundantes. Esto reduce el número de animales que se requieren para un proyecto determinado. El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave con respecto a los protocolos metabolómicos tradicionales, como el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en acetonitrilo y la utilización de una cuantificación dirigida con un uso riguroso de estándares internos, lo que permite mediciones más precisas y completas del metabolismo celular. A pesar del tiempo necesario para el aislamiento de células individuales, la tinción fluorescente y la clasificación, el protocolo puede preservar en gran medida las diferencias entre los tipos de células y los tratamientos farmacológicos.
Introduction
El metabolismo es un proceso biológico esencial que ocurre en todas las células vivas. Los procesos metabólicos implican una vasta red de reacciones bioquímicas que están estrechamente reguladas e interconectadas, lo que permite a las células producir energía y sintetizarbiomoléculas esenciales. Para comprender la función de las redes metabólicas, los investigadores miden los niveles de intermediarios de moléculas pequeñas dentro de las células. Estos intermediarios sirven como indicadores importantes de la actividad metabólica y pueden revelar información crítica sobre la función celular.
La espectrometría de masas (MS) es la opción más popular para la detección específica de metabolitos en muestras complejas 1,2. La resonancia magnética nuclear (RMN) tiene ventajas en la cuantificación absoluta de compuestos y la elucidación de estructuras, pero la EM a menudo puede resolver más componentes en mezclas complejas como biofluidos o extractos celulares. La mayoría de las veces, la EM se combina con la separación previa del compuesto mediante electroforesis capilar (CE), cromatografía de gases (GC) o cromatografía líquida (LC)3. La elección de la plataforma de separación depende principalmente de la gama de metabolitos objetivo y del tipo de muestra y, en un entorno real, de la disponibilidad de máquinas y experiencia. Las tres plataformas de separación tienen una amplia gama de metabolitos adecuados, pero diferentes limitaciones. En resumen, la CE solo puede separar moléculas cargadas y requiere mucha experiencia para implementar un análisis robusto de una gran cantidad de muestras4. La GC se limita a moléculas que son lo suficientemente pequeñas y apolares como para evaporarse antes dedescomponerse. Teniendo en cuenta todas las columnas de LC disponibles en el mercado, dos metabolitos cualesquiera pueden separarse mediante esta tecnología5. Sin embargo, muchos métodos de LC exhiben menos poder de resolución que los métodos CE o GC de longitud similar.
La cantidad típica de material de partida para las mediciones metabolómicas suele estar en el rango de 5 x 105 a 5 x 107 células por muestra, 5-50 mg de tejido húmedo o 5-50 μL de líquido corporal6. Sin embargo, puede ser difícil obtener tales cantidades de material de partida cuando se trabaja con células primarias de tipos celulares raros, como por ejemplo las células madre hematopoyéticas (CMH) o las células tumorales circulantes. Estas células a menudo están presentes en cantidades muy bajas y no se pueden cultivar sin comprometer las características celulares críticas.
Las HSC y las células progenitoras multipotentes (MPP) son las células menos diferenciadas del sistema hematopoyético y producen continuamente nuevas células sanguíneas a lo largo de la vida de un organismo. La regulación de la hematopoyesis es de relevancia clínica en afecciones como la leucemia y la anemia. A pesar de su importancia, las HSC y las MPP se encuentran entre las células más raras dentro del sistema hematopoyético. De un solo ratón, típicamente, se pueden aislar alrededor de 5000 HSC 7,8,9. Dado que los métodos metabolómicos tradicionales requieren más material de entrada, a menudo era necesario agrupar células de varios ratones para analizar tipos de células raras10,11.
Aquí, nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que permitiera la medición de metabolitos en tan solo 5000 células por muestra para permitir la generación de datos metabolómicos a partir de las HSC de un solo ratón12. Al mismo tiempo, este método permite generar múltiples réplicas a partir de un solo ratón para tipos celulares más abundantes como los linfocitos. Este enfoque reduce el número de animales necesarios para un proyecto determinado, contribuyendo así a las “3R” (reducción, reemplazo, refinamiento) de los experimentos con animales.
Los metabolitos en las células pueden tener tasas de renovación muy altas, a menudo del orden de segundos13. Sin embargo, la preparación de muestras para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede llevar horas, y la clasificación FACS en sí misma puede llevar de minutos a horas, lo que lleva a posibles alteraciones en el metaboloma debido a condiciones no fisiológicas. Algunos de los reactivos utilizados en este protocolo (como el tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio [ACK]) pueden tener efectos similares. Estas condiciones pueden causar estrés celular y afectar los niveles y proporciones de metabolitos dentro de las células, lo que lleva a mediciones inexactas o sesgadas del metabolismo celular 14,15,16. Los cambios metabólicos debidos a la preparación de la muestra a veces se denominan artefactos de clasificación. Los largos protocolos de digestión y los reactivos agresivos que pueden ser necesarios para producir suspensiones unicelulares a partir de tejidos duros o duros pueden agravar este problema. Es probable que los cambios que se pueden producir dependan del tipo de célula y de la condición de procesamiento. La naturaleza precisa de los cambios sigue siendo desconocida, ya que no se puede medir el estado metabólico de las células no perturbadas en el tejido vivo.
El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave en comparación con los métodos tradicionales, a saber, el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en tampón de extracción, la inyección de grandes volúmenes de muestra en cromatografía líquida de interacción hidrofílica-espectrometría de masas (HILIC-MS) y la utilización de cuantificación dirigida, el uso riguroso de patrones internos y controles de fondo (Figura 1). Este protocolo tiene el potencial de preservar en gran medida las diferencias entre los tipos celulares y entre el tratamiento farmacológico y el control vehicular12. Incluso en el caso de las células cultivadas, se compara favorablemente con los enfoques alternativos, como la centrifugación más establecida y la eliminación manual del sobrenadante. Sin embargo, dado que aún pueden producirse artefactos de ordenación, los datos deben interpretarse con precaución. A pesar de esta limitación, el protocolo representa una mejora significativa en el campo de los perfiles metabólicos, permitiendo mediciones más precisas y completas del metabolismo celular en células primarias raras12.
La capacidad de medir de forma robusta amplios perfiles metabólicos en células primarias raras abre la puerta a nuevos experimentos en la investigación biomédica que involucran estas células. Por ejemplo, se ha demostrado que la regulación metabólicamente mediada en las HSC tiene un impacto en la capacidad de autorrenovación de la latencia, con implicaciones para la anemia y la leucemia11,17. En las células tumorales circulantes derivadas de pacientes, se han demostrado diferencias en la expresión de genes metabólicos entre el tumor y las células adyacentes18,19. Este protocolo permite ahora a los investigadores estudiar estas diferencias de forma sistemática a nivel metabólico, que generalmente se considera más cercano al fenotipo celular que a la expresión génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos para la implementación exitosa de la metabolómica dirigida utilizando este protocolo son: 1) una estrategia robusta de tinción y compuerta que produzca poblaciones celulares limpias, 2) el manejo preciso de los volúmenes líquidos, 3) el tiempo reproducible de todos los pasos experimentales, en particular todos los pasos previos a la extracción del metabolito. Idealmente, todas las muestras que pertenecen a un experimento deben procesarse y medirse en un lote para minimizar los efectos del l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la instalación de animales del Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética por proporcionar los animales utilizados en este estudio.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
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