Riktad metabolomik på sällsynta primära celler
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att noggrant och tillförlitligt mäta metaboliter i sällsynta celltyper. Tekniska förbättringar, inklusive en modifierad mantelvätska för cellsortering och generering av relevanta blankprover, möjliggör en omfattande kvantifiering av metaboliter med en inmatning på endast 5000 celler per prov.
Abstract
Cellulär funktion är kritiskt beroende av metabolismen, och funktionen hos de underliggande metaboliska nätverken kan studeras genom att mäta små molekylära intermediärer. För att få exakta och tillförlitliga mätningar av cellulär metabolism, särskilt i sällsynta celltyper som hematopoetiska stamceller, har det traditionellt krävts att man slagit samman celler från flera djur. Ett protokoll gör det nu möjligt för forskare att mäta metaboliter i sällsynta celltyper med endast en mus per prov samtidigt som flera replikat genereras för mer förekommande celltyper. Detta minskar antalet djur som krävs för ett visst projekt. Protokollet som presenteras här innebär flera viktiga skillnader jämfört med traditionella metabolomikprotokoll, såsom att använda 5 g/L NaCl som mantelvätska, sortera direkt i acetonitril och använda riktad kvantifiering med rigorös användning av interna standarder, vilket möjliggör mer exakta och omfattande mätningar av cellulär metabolism. Trots den tid som krävs för isolering av enskilda celler, fluorescerande färgning och sortering kan protokollet i stor utsträckning bevara skillnader mellan celltyper och läkemedelsbehandlingar.
Introduction
Metabolism är en essentiell biologisk process som sker i alla levande celler. Metaboliska processer involverar ett stort nätverk av biokemiska reaktioner som är tätt reglerade och sammankopplade, vilket gör det möjligt för celler att producera energi och syntetisera viktiga biomolekyler1. För att förstå funktionen hos metaboliska nätverk mäter forskarna nivåerna av småmolekylära intermediärer i celler. Dessa intermediärer fungerar som viktiga indikatorer på metabolisk aktivitet och kan avslöja viktiga insikter om cellulär funktion.
Masspektrometri (MS) är det mest populära valet för specifik detektion av metaboliter i komplexa prover 1,2. Kärnmagnetisk resonans (NMR) har fördelar när det gäller absolut kvantifiering av föreningar och strukturbestämning, men MS kan ofta lösa upp fler komponenter i komplexa blandningar som biovätskor eller cellextrakt. Oftast kombineras MS med tidigare separation av föreningen genom kapillärelektrofores (CE), gaskromatografi (GC) eller vätskekromatografi (LC)3. Valet av separationsplattform styrs främst av utbudet av målmetaboliter och typen av prov och, i en verklig miljö, av tillgången på maskiner och expertis. Alla tre separationsplattformarna har ett brett och överlappande utbud av lämpliga metaboliter men olika begränsningar. Kortfattat kan CE endast separera laddade molekyler och kräver mycket expertis för att genomföra robust analys av ett stort antal prover4. GC är begränsat till molekyler som är små och apolära nog att avdunsta innan de sönderdelas3. Med tanke på alla kommersiellt tillgängliga LC-kolonner kan vilka två metaboliter som helst separeras med denna teknik5. Många LC-metoder uppvisar dock mindre upplösningsförmåga än CE- eller GC-metoder av liknande längd.
Den typiska mängden utgångsmaterial för metabolomikmätningar ligger vanligtvis i intervallet 5 x 105 till 5 x 107 celler per prov, 5-50 mg våt vävnad eller 5-50 μL kroppsvätska6. Det kan dock vara svårt att få tag på sådana mängder utgångsmaterial när man arbetar med primära celler av sällsynta celltyper, som till exempel hematopoetiska stamceller (HSC) eller cirkulerande tumörceller. Dessa celler finns ofta i mycket små antal och kan inte odlas utan att kompromissa med kritiska cellulära egenskaper.
HSC och multipotenta progenitorceller (MPP) är de minst differentierade cellerna i det hematopoetiska systemet och producerar kontinuerligt nya blodceller under en organisms liv. Regleringen av hematopoes är av klinisk relevans vid tillstånd som leukemi och anemi. Trots sin betydelse är HSC och MPP bland de mest sällsynta cellerna i det hematopoetiska systemet. Från en enda mus kan vanligtvis cirka 5000 HSC:er isoleras 7,8,9. Eftersom traditionella metabolomikmetoder kräver mer ingående material var det ofta nödvändigt att slå samman celler från flera möss för att analysera sällsynta celltyper10,11.
Här syftade vi till att utveckla ett protokoll som möjliggör mätning av metaboliter i så lite som 5000 celler per prov för att möjliggöra generering av metabolomikdata från HSCs från en enda mus12. Samtidigt gör denna metod det möjligt att generera flera replikat från en enda mus för rikligare celltyper som lymfocyter. Detta tillvägagångssätt minskar antalet djur som krävs för ett visst projekt, vilket bidrar till “3R” (minskning, ersättning, förfining) av djurförsök.
Metaboliter i celler kan ha mycket höga omsättningshastigheter, ofta i storleksordningensekunder 13. Att förbereda prover för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan dock ta timmar, och själva FACS-sorteringen kan ta minuter till timmar, vilket leder till potentiella förändringar i metabolomet på grund av icke-fysiologiska förhållanden. Vissa av de reagenser som används i detta protokoll (t.ex. ammonium-klorid-kalium [ACK] lysbuffert) kan ha liknande effekter. Dessa tillstånd kan orsaka cellulär stress och påverka nivåerna och förhållandena av metaboliter i celler, vilket leder till felaktiga eller partiska mätningar av cellulär metabolism 14,15,16. De metaboliska förändringarna på grund av provberedning kallas ibland sorteringsartefakter. Långa matsmältningsprotokoll och starka reagenser som kan krävas för att producera encellssuspensioner från hårda eller hårda vävnader kan förvärra detta problem. Vilka förändringar som kan uppstå beror sannolikt på celltypen och bearbetningsförhållandena. Den exakta karaktären av förändringarna är fortfarande okänd, eftersom det metaboliska tillståndet hos de ostörda cellerna i den levande vävnaden inte kan mätas.
Protokollet som presenteras här innehåller flera viktiga skillnader jämfört med traditionella metoder, nämligen användningen av 5 g/L NaCl som mantelvätska, sortering direkt i extraktionsbuffert, injicering av stora provvolymer på hydrofil interaktion vätskekromatografi-masspektrometri (HILIC-MS), och användning av riktad kvantifiering, rigorös användning av interna standarder och bakgrundskontroller (Figur 1). Detta protokoll har potential att istor utsträckning bevara skillnader mellan celltyper och mellan läkemedelsbehandling och vehikelkontroll. Även för odlade celler kan det jämföras med alternativa metoder, såsom den mer etablerade centrifugeringen och manuell borttagning av supernatant. Men eftersom sorteringsartefakter fortfarande kan uppstå måste data tolkas med försiktighet. Trots denna begränsning representerar protokollet en betydande förbättring inom området metabolisk profilering, vilket möjliggör mer exakta och omfattande mätningar av cellulär metabolism i sällsynta primära celler12.
Möjligheten att på ett robust sätt mäta breda metaboliska profiler i sällsynta primära celler öppnar dörren för nya experiment inom biomedicinsk forskning som involverar dessa celler. Till exempel har metaboliskt medierad reglering i HSC visat sig påverka förmågan att förnya sig i dvala, med implikationer för anemi och leukemi11,17. I cirkulerande tumörceller från patienter har skillnader i uttrycket av metabola gener mellan tumör och intilliggande celler visats18,19. Detta protokoll gör det nu möjligt för forskare att studera dessa skillnader systematiskt på en metabolisk nivå, som allmänt anses ligga närmare den cellulära fenotypen än genuttrycket.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik implementering av riktad metabolomik med hjälp av detta protokoll är 1) en robust färgnings- och gatingstrategi som kommer att ge rena cellpopulationer 2) exakt hantering av vätskevolymer, 3) reproducerbar timing av alla experimentella steg, i synnerhet alla steg före metabolitextraktion. Helst bör alla prover som tillhör ett experiment bearbetas och mätas i en sats för att minimera satseffekter22. För större experiment föreslår vi att man sa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka djuranläggningen vid Max Planck-institutet för immunobiologi och epigenetik för att ha tillhandahållit de djur som användes i denna studie.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
