Summary

Таргетная метаболомика на редких первичных клетках

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для точного и надежного измерения метаболитов в редких типах клеток. Технические усовершенствования, в том числе модифицированная жидкость оболочки для сортировки клеток и генерация соответствующих пустых образцов, позволяют проводить всестороннюю количественную оценку метаболитов с вводом всего 5000 клеток на образец.

Abstract

Клеточная функция критически зависит от метаболизма, и функцию лежащих в ее основе метаболических сетей можно изучить, измеряя низкомолекулярные промежуточные продукты. Тем не менее, получение точных и надежных измерений клеточного метаболизма, особенно в редких типах клеток, таких как гемопоэтические стволовые клетки, традиционно требовало объединения клеток нескольких животных. Теперь протокол позволяет исследователям измерять метаболиты в редких типах клеток, используя только одну мышь на образец, создавая при этом несколько репликаций для более распространенных типов клеток. Это уменьшает количество животных, которые требуются для данного проекта. Протокол, представленный здесь, имеет несколько ключевых отличий от традиционных протоколов метаболомики, таких как использование 5 г/л NaCl в качестве жидкости оболочки, сортировка непосредственно в ацетонитрил и использование целевого количественного определения со строгим использованием внутренних стандартов, что позволяет проводить более точные и всесторонние измерения клеточного метаболизма. Несмотря на время, необходимое для выделения отдельных клеток, флуоресцентного окрашивания и сортировки, протокол может в значительной степени сохранить различия между типами клеток и лекарственными препаратами.

Introduction

Метаболизм – это важнейший биологический процесс, происходящий во всех живых клетках. Метаболические процессы включают в себя обширную сеть биохимических реакций, которые жестко регулируются и взаимосвязаны, позволяя клеткам вырабатывать энергию и синтезировать необходимыебиомолекулы. Чтобы понять функцию метаболических сетей, исследователи измеряют уровни низкомолекулярных промежуточных продуктов в клетках. Эти промежуточные продукты служат важными индикаторами метаболической активности и могут дать важную информацию о клеточной функции.

Масс-спектрометрия (МС) является наиболее популярным выбором для специфического обнаружения метаболитов в сложных образцах 1,2. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) имеет преимущества в абсолютном количественном определении соединений и выяснении структуры, но МС часто позволяет разрешать большее количество компонентов в сложных смесях, таких как биожидкости или клеточные экстракты. Чаще всего РС сочетается с предварительным разделением соединения с помощью капиллярного электрофореза (КЭ), газовой хроматографии (ГХ) или жидкостной хроматографии (ЖХ)3. Выбор платформы сепарации в основном определяется диапазоном целевых метаболитов и типом образца, а в реальных условиях — доступностью оборудования и опыта. Все три сепарационные платформы имеют широкий и перекрывающийся диапазон подходящих метаболитов, но различные ограничения. Короче говоря, КЭ может разделять только заряженные молекулы и требует большого опыта для осуществления надежного анализа большого количества образцов4. ГХ ограничен молекулами, которые достаточно малы и аполярны, чтобы испариться перед разложением3. Учитывая все коммерчески доступные колонки LC, любые два метаболита могут быть разделены с помощью этой технологии5. Тем не менее, многие методы LC обладают меньшей разрешающей способностью, чем методы CE или GC аналогичной длины.

Типичное количество исходного материала для метаболомных измерений обычно находится в диапазоне от 5 x 105 до 5 x 107 клеток на образец, 5-50 мг влажной ткани или 5-50 мкл биологической жидкости6. Однако при работе с первичными клетками редких типов клеток, таких как, например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) или циркулирующие опухолевые клетки, может быть сложно получить такое количество исходного материала. Эти клетки часто присутствуют в очень малых количествах и не могут быть культивированы без ущерба для критически важных клеточных характеристик.

ГСК и мультипотентные клетки-предшественники (MPP) являются наименее дифференцированными клетками кроветворной системы и непрерывно производят новые клетки крови на протяжении всей жизни организма. Регуляция кроветворения имеет клиническое значение при таких состояниях, как лейкемия и анемия. Несмотря на свою важность, ГСК и МПП являются одними из самых редких клеток в кроветворной системе. От одной мыши, как правило, можно выделить около 5000 ГСК 7,8,9. Поскольку традиционные методы метаболомики требуют большего количества входного материала, для анализа редких типов клеток10,11 часто приходилось объединять клетки нескольких мышей.

Здесь мы стремились разработать протокол, который позволяет измерять метаболиты всего в 5000 клетках на образец, чтобы обеспечить генерацию метаболомных данных из ГСК одной мыши12. В то же время этот метод позволяет генерировать несколько репликаций из одной мыши для более распространенных типов клеток, таких как лимфоциты. Такой подход уменьшает количество животных, необходимых для данного проекта, тем самым способствуя «3R» (сокращение, замена, уточнение) экспериментов на животных.

Метаболиты в клетках могут иметь очень высокую скорость оборота, часто порядка13 секунд. Тем не менее, подготовка образцов для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) может занять несколько часов, а сама сортировка FACS может занять от нескольких минут до нескольких часов, что приводит к потенциальным изменениям в метаболоме из-за нефизиологических условий. Некоторые из реагентов, используемых в этом протоколе (например, лизисный буфер аммония-хлорида-калия [ACK]), могут иметь аналогичные эффекты. Эти условия могут вызывать клеточный стресс и влиять на уровни и соотношение метаболитов в клетках, что приводит к неточным или смещенным измерениям клеточного метаболизма 14,15,16. Метаболические изменения, вызванные пробоподготовкой, иногда называют артефактами сортировки. Длительные протоколы пищеварения и жесткие реагенты, которые могут потребоваться для получения одноклеточной суспензии из твердых или жестких тканей, могут усугубить эту проблему. Какие изменения могут произойти, скорее всего, зависит от типа клетки и условий обработки. Точная природа изменений остается неизвестной, так как метаболическое состояние ненарушенных клеток в живой ткани не может быть измерено.

Представленный здесь протокол включает в себя несколько ключевых отличий по сравнению с традиционными методами, а именно: использование 5 г/л NaCl в качестве жидкости оболочки, сортировка непосредственно в буфер экстракции, введение больших объемов образцов для жидкостной хромато-масс-спектрометрии с гидрофильным взаимодействием (HILIC-MS) и использование целевого количественного определения, строгое использование внутренних стандартов и фонового контроля (рис. 1). Этот протокол обладает потенциалом для сохранения различий между типами клеток, а также между лекарственным лечением и контролем транспортных средств в значительной степени12. Даже для культивируемых клеток он выгодно отличается от альтернативных подходов, таких как более традиционное центрифугирование и ручное удаление надосадочной жидкости. Однако, поскольку артефакты сортировки все еще могут возникать, данные следует интерпретировать с осторожностью. Несмотря на это ограничение, протокол представляет собой значительное улучшение в области метаболического профилирования, позволяя проводить более точные и всесторонние измерения клеточного метаболизма в редких первичных клетках12.

Возможность надежно измерять широкие метаболические профили в редких первичных клетках открывает дверь для новых экспериментов в биомедицинских исследованиях с участием этих клеток. Например, было показано, что метаболически опосредованная регуляция в ГСК влияет на способность к самообновлению в состоянии покоя, что имеет значение для анемии и лейкемии11,17. В циркулирующих опухолевых клетках, полученных от пациентов, были показаны различия в экспрессии метаболических генов между опухолью и соседними клетками18,19. Этот протокол теперь позволяет исследователям систематически изучать эти различия на метаболическом уровне, который обычно рассматривается как более близкий к клеточному фенотипу, чем экспрессия генов.

Protocol

Разведение и содержание всех мышей, использованных для этого протокола, проводилось в обычном животноводческом помещении в Институте иммунобиологии и эпигенетики Макса Планка (MPI-IE) в соответствии с правилами местных властей (Regierungspräsidium Freiburg). Мышей усыпляли с помощьюСО2 и вывиха…

Representative Results

Сортировка FACS позволяет выделять чистые популяции различных типов клеток из одной и той же клеточной суспензии (рис. 2 и рис. 3). Специфичность этого метода заключается в окрашивании различных типов клеток специфическими поверхностными маркерами (наприм?…

Discussion

Наиболее важными шагами для успешной реализации таргетной метаболомики с использованием этого протокола являются: 1) надежная стратегия окрашивания и стробирования, которая позволит получить популяции чистых клеток, 2) точное обращение с объемами жидкости, 3) воспроизводимое время все…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Институт иммунобиологии и эпигенетики им. Макса Планка за предоставление животных, использованных в этом исследовании.

Materials

13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

Riferimenti

  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).

Play Video

Citazione di questo articolo
Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

View Video