Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.
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Articolo metodologico
Metabolomica mirata su cellule primarie rare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La funzione cellulare dipende in modo critico dal metabolismo e la funzione delle reti metaboliche sottostanti può essere studiata misurando gli intermedi di piccole molecole. Tuttavia, l'ottenimento di misurazioni accurate e affidabili del metabolismo cellulare, in particolare in tipi di cellule rare come le cellule staminali ematopoietiche, ha tradizionalmente richiesto il raggruppamento di cellule provenienti da più animali. Un protocollo consente ora ai ricercatori di misurare i metaboliti in tipi di cellule rare utilizzando un solo topo per campione, generando al contempo più repliche per tipi di cellule più abbondanti. In questo modo si riduce il numero di animali necessari per un determinato progetto. Il protocollo qui presentato comporta diverse differenze chiave rispetto ai protocolli metabolomici tradizionali, come l'utilizzo di 5 g/L di NaCl come fluido di guaina, lo smistamento diretto in acetonitrile e l'utilizzo di una quantificazione mirata con un uso rigoroso di standard interni, consentendo misurazioni più accurate e complete del metabolismo cellulare. Nonostante il tempo necessario per l'isolamento delle singole cellule, la colorazione fluorescente e lo smistamento, il protocollo può preservare in larga misura le differenze tra i tipi di cellule e i trattamenti farmacologici.
Introduzione
Il metabolismo è un processo biologico essenziale che si verifica in tutte le cellule viventi. I processi metabolici coinvolgono una vasta rete di reazioni biochimiche strettamente regolate e interconnesse, consentendo alle cellule di produrre energia e sintetizzare biomolecole essenziali1. Per comprendere la funzione delle reti metaboliche, i ricercatori misurano i livelli di piccole molecole intermedie all'interno delle cellule. Questi intermedi fungono da importanti indicatori dell'attività metabolica e possono rivelare informazioni critiche sulla funzione cellulare.
La spettrometria di massa (MS) è la scelta più ....
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Protocollo
L'allevamento e l'allevamento di tutti i topi utilizzati per questo protocollo sono stati condotti in una struttura per animali convenzionale presso l'Istituto Max Planck per l'immunobiologia e l'epigenetica (MPI-IE) secondo i regolamenti delle autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg). I topi sono stati sottoposti a eutanasia con CO2 e lussazione cervicale da personale addestrato FELASA B seguendo le linee guida e i regolamenti approvati dal comitato per il benessere degli animali del MPI-IE e dalle autorità locali. Non è stata eseguita alcuna sperimentazione animale e i topi non hanno avuto problemi di salute.
NOTA: I meto....
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Risultati
Il sorting FACS consente l'isolamento di popolazioni pulite di diversi tipi di cellule dalla stessa sospensione cellulare (Figura 2 e Figura 3). La specificità di questo metodo si basa sulla colorazione dei diversi tipi di cellule con specifici marcatori di superficie (ad esempio, cellule B e cellule T della milza) o combinazioni specifiche di marcatori di superficie (ad esempio HSC e MPP). La colorazione dei marcatori intracellulari richiede in genere la permea.......
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Discussione
I passaggi più critici per un'implementazione di successo della metabolomica mirata utilizzando questo protocollo sono 1) una robusta strategia di colorazione e gating che produrrà popolazioni cellulari pulite 2) una gestione precisa dei volumi di liquido, 3) una tempistica riproducibile di tutte le fasi sperimentali, in particolare tutte le fasi precedenti all'estrazione del metabolita. Idealmente, tutti i campioni appartenenti a un esperimento dovrebbero essere processati e misurati in un lotto per ridurre al minimo gl.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la struttura animale del Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics per aver fornito gli animali utilizzati in questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 13C estratto di lievito | Soluzioni isotopiche | ISO-1 | |
| 40 µ Filtro cellulare m | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, grado LC-MS | VWR | 83640.32 | |
| ACK tampone di lisi | Gibco | 104921 | In alternativa: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosina difosfato (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosina monofosfato (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosina trifosfato (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Carbonato di ammonio, grado HPLC | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Colonna Atlantis Premier BEH Z-HILIC (100 x 2,1 mm, 1,7 &; m) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Kit di cellule CD4 di topo intatte Dynabeads... | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Lamina termosaldante | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucina | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Fonte | Agilent | G1958B | |
| Leucina | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Acido medronico | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Metanolo, grado LC-MS | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Spettrometro di massa a triplo quadrupolo | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR piastra 96 pozzetti LoBind con gonna | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autocampionatore | Agilent | G7157B | |
| Termostato a colonna UHPLC | Agilent | G7116B | |
| Pompa UHPLC | Agilent | G7120A | |
| Termostato campione UHPLC | Agilent | G4761A |
Riferimenti
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 27....
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Ristampe e permessi
