Denna metod ger ett tillgängligt och flexibelt protokoll för beredning av elektronmikroskopinät (EM) för in situ cellulär kryotomografi och korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM).
In situ cellulär kryotomografi är en kraftfull teknik för att studera komplexa objekt i deras ursprungliga frysta hydratiserade cellulära sammanhang, vilket gör den mycket relevant för cellbiologi och virologi. Potentialen att kombinera kryotomografi med andra mikroskopimodaliteter gör det till en perfekt teknik för integrativ och korrelativ avbildning. Provberedning för in situ celltomografi är dock inte okomplicerad, eftersom celler inte lätt fäster och sträcker sig över elektronmikroskopinätet. Dessutom är själva rutnäten ömtåliga och kan gå sönder om de hanteras för kraftfullt, vilket resulterar i förlust av bildbara områden. Geometrin hos vävnadsodlingsskålar kan också utgöra en utmaning när man manipulerar gallren med pincett. Här beskriver vi tips och tricks för att övervinna dessa (och andra) utmaningar och förbereda prover av god kvalitet för in situ cellulär kryotomografi och korrelativ avbildning av vidhäftande däggdjursceller. Med fortsatta framsteg inom kryomikroskopiteknik är denna teknik enormt lovande för att främja vår förståelse av komplexa biologiska system.
In situ cellulär kryotomografi är en kraftfull teknik som möjliggör studier av biologiskt relevanta strukturer i celler utan kemisk fixering. Genom att fästa celler vid EM-galler och djupfrysa gallren i en kryogen fryses objekt av intresse i sina naturliga cellulära sammanhang utan att det bildas kristallin is från intracellulärt vatten 1,2. Både kemisk fixering och kristallin isbildning kan störa strukturerna hos relevanta molekyler, såsom proteiner och lipider, vilket minskar den biologiska noggrannheten hos bilder som erhålls med dessa tekniker 3,4. I tomografi avbildas rutnät i inkrementella vinklar med hjälp av elektronmikroskopi, och dessa bilder används sedan för att konstruera tredimensionella representationer av målområdet avbildat5. In situ kryotomografi kan användas tillsammans med andra mikroskopitekniker för integrativ och korrelativ avbildning, såsom kryofluorescensavbildning, mjukröntgentomografi och kryoFIB/SEM (kryogen fokuserad jonstråle/svepelektronmikroskopi)6,7,8,9,10,11 . Integrering av flera tekniker gör det möjligt att få mer information om en struktur eller process än vad någon enskild mikroskopiteknik kan uppnå.
Trots alla fördelar med cellulär kryotomografi in situ kan provberedning visa sig vara utmanande av olika anledningar. På grund av deras bräcklighet kan kraftfull manipulation av elektronmikroskopigaller leda till skador, där det tunna kolskiktet i synnerhet är känsligt och benäget att rivas sönder, vilket minskar den bildbara ytan av gallren. Elektronmikroskopinät är också svåra att manipulera på grund av sin lilla storlek och är benägna att lossna från ytan av brunnarna eller mikroglaset som används för att odla celler. Manipulation av gallren i brunnarna eller mikroobjekten kan visa sig vara svårt på grund av geometrin hos dessa. Felaktig förberedelse av gallren (t.ex. genom att låta dem flyta) kan leda till låg celltäthet och minska antalet potentiella avbildningsområden, särskilt när cellerna inte är benägna att fästa vid själva gallren. För direkt cellulär kryotomografi måste cellerna spridas mycket tunt, vilket kan störas av många anledningar, inklusive felaktiga temperaturer eller grov hantering av gallren.
Genom en mängd olika optimeringar är teknikerna som presenteras i den här artikeln avsedda att hantera dessa vanligaste fallgropar som uppstår vid framställning av elektronmikroskopinät för kryotomografi. Användningen av 5/15 vinklade pincetter gör det möjligt att manipulera galler i brunnsplattor eller mikroobjekt. En fibronektinlösning som appliceras på båda sidor av gallren före plätering gör flytande galler mindre sannolika, vilket är fördelaktigt för att säkerställa att gallren har tillräcklig celltäthet och att gallren är mindre benägna att skadas på grund av manipulation. Genom att hålla gallren inkuberade vid 37 °C fram till strax före nedfrysning ser vi också till att cellerna förvaras i en behaglig miljö för att förhindra att cellerna drar tillbaka sina tunna kanter. Att torka gallren från baksidan förhindrar också skador på cellerna från mekanisk kraft. Sammantaget ökar dessa åtgärder framgångsgraden för provberedning för in situ cellulära kryotomografistudier, vilket ökar tillgängligheten för denna avbildningsmetod.
Här har vi tillhandahållit ett tillgängligt, flexibelt och reproducerbart protokoll för fröceller på elektronmikroskopinät för in situ kryoelektrontomografiapplikationer. Denna metod kan enkelt anpassas för att passa behoven hos nedströmstillämpningar och/eller experimentella krav. Förutom stor flexibilitet har vi beskrivit ett arbetsflöde som optimerar och minskar vanliga fallgropar i rutnätssådd, särskilt omfattande skador på kollagret, låg celldensitet och dålig strukturell integritet hos tunncellsprojektioner.
Även om protokollet som beskrivs här ger flera alternativ, finns det några viktiga steg som bör följas för att optimera allmänna resultat. Ett av de största problemen med frösådd av rutnätsceller är att rutnät lossnar och flyter från brunnen eller mikroobjektglaset. Därför är det viktigt att blöta gallret helt med en vidhäftande lösning på båda sidor och förhindra att det torkar under inkubationstiden. Om du använder 3D-printade gallerhållare ska du vara medveten om att flera byten av media till dessa hållare har potential att producera flytande galler eftersom luften som fångas under gallret kan tvinga ut den ur hållaren.
Vårt val av pincett förbättrar också gallerkvaliteten genom att ge ett geometriskt gynnsamt sätt att manipulera gallren utan omfattande rutnätsböjning som skulle skada kolskiktet. Att hålla cellerna vid 37 °C så länge som möjligt innan de störtar minskar cellernas lidande och förbättrar antalet tunna avbildbara celler i gallret. Slutligen kommer blotting från guldsidan att skydda cellerna från hårda mekaniska krafter som kan leda till skador på ömtåliga cellulära strukturer.
Även om det inte ingår i detta protokoll, har rutnätsfotomikromönstring visat sig öka antalet bildbara celler genom att optimera deras bindning till mitten av rutnätsrutor14. Slutligen har 3D-printade gallerhållare nyligen använts för att minska skador på nätet genom att begränsa direkt gallermanipulation12.
Det kan vara viktigt att notera att detta protokoll är optimerat för avbildning av tunna kanter och utsprång från celler för applicering av kryotomografi. Vi föreslår att du felsöker en mängd olika villkor från våra rekommendationer i protokollet för att hitta det bästa resultatet för de underordnade program som du väljer. Sammantaget ger detta protokoll en pålitlig men ändå mångsidig metod för att seeda celler på rutnät som kan justeras för specifika behov.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Mansky-labbet för tillgången till djupfrysningsutrustning. Delar av detta arbete utfördes i karakteriseringsanläggningen vid University of Minnesota, som delvis får stöd från National Science Foundation (NSF) genom Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC; Utmärkelsenummer DMR-2011401) och National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Utmärkelsenummer ECCS-2025124) program. Vi vill tacka finansieringen från Behavior of HIV in Viral Environments center (B-HIVE; 1U54AI170855-01) och Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) centrum.
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |