यहां, हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए ग्राफीन के एकल मोनोलेयर को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोईएम संरचना निर्धारण में उपयोग के लिए उन्हें कैसे तैयार करें।
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की परमाणु संरचना की जांच के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है। क्रायोईएम के लिए नमूना तैयार करने के लिए विट्रस बर्फ की एक पतली परत में नमूनों को संरक्षित करने की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर एक फेनेस्टेड सपोर्ट फिल्म के छेद के भीतर निलंबित होती है। हालांकि, क्रायोईएम अध्ययनों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले सभी नमूना तैयारी दृष्टिकोण नमूने को वायु-जल इंटरफ़ेस में उजागर करते हैं, जिससे नमूने पर एक मजबूत हाइड्रोफोबिक प्रभाव पेश होता है जिसके परिणामस्वरूप अक्सर विकृतीकरण, एकत्रीकरण और जटिल पृथक्करण होता है। इसके अलावा, नमूना और वायु-जल इंटरफ़ेस के क्षेत्रों के बीच पसंदीदा हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन मैक्रोमोलेक्यूल द्वारा अपनाए गए झुकाव को प्रभावित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनिसोट्रोपिक दिशात्मक संकल्प के साथ 3 डी पुनर्निर्माण होता है।
ग्राफीन के एक मोनोलेयर में क्रायोईएम नमूनों के सोखने को पृष्ठभूमि शोर की शुरूआत को कम करते हुए वायु-जल इंटरफ़ेस के साथ बातचीत को कम करने में मदद करने के लिए दिखाया गया है। ग्राफीन समर्थन क्रायोईएम इमेजिंग के लिए आवश्यक प्रोटीन की आवश्यक एकाग्रता को काफी हद तक कम करने का लाभ भी प्रदान करता है। इन समर्थनों के फायदों के बावजूद, वाणिज्यिक विकल्पों के निषेधात्मक खर्च और बड़े पैमाने पर इन-हाउस उत्पादन से जुड़ी चुनौतियों के कारण क्रायोईएम समुदाय द्वारा ग्राफीन-लेपित ग्रिड का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। यह पेपर क्रायोईएम ग्रिड के बैच तैयार करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है जिसमें मोनोलेयर ग्राफीन का लगभग पूर्ण कवरेज होता है।
एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एक तेजी से लागू तकनीक है जिसका उपयोग बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स की 3 डी संरचनाओं की जांच के लिए किया जाता है। पिछले एक दशक में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स, प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन पहचान1, और कंप्यूटर एल्गोरिदम 2,3,4 में तकनीकी प्रगति ने क्रायोईएम उपयोगकर्ताओं को जैव रासायनिक रूप से स्थिर मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 5,6,7,8 तक निर्धारित करने में सक्षम बनाया है।. इन प्रगति के बावजूद, क्रायोईएम इमेजिंग के लिए नमूनों को संरक्षित करने के लिए उल्लेखनीय बाधाएं बनी हुई हैं, जो अधिकांश जैविक नमूनों को इस तरह के उच्च रिज़ॉल्यूशन तक हल करने से रोकती हैं।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी में मैक्रोमोलेक्यूल्स को फंसाना शामिल है जो विट्रीफाइड बर्फ की एक पतली परत के भीतर झुकाव की एक विस्तृत श्रृंखला में समान रूप से वितरित होते हैं। फ्रीजिंग के “ब्लॉट एंड प्लांक” तरीके क्रायोईएम अध्ययन 9,10 के लिए ग्रिड पर जैविक नमूनों की पतली फिल्मों को उत्पन्न करने के लिए नियोजित सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं। इन विधियों में एक ईएम ग्रिड में नमूना समाधान के कुछ माइक्रोलीटर को लागू करना शामिल है जिसमें एक फेनेस्टेड फिल्म होती है जिसे हाइड्रोफिलिक बनाया गया है और बाद में ग्रिड को तरल ईथेन या ईथेन-प्रोपेन मिश्रण9 के क्रायोजेन में तेजी से डुबोने से पहले फिल्टर पेपर के साथ अधिकांश नमूने को सोख लेना शामिल है।
जबकि इस विधि का उपयोग जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला की संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, सभी आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले क्रायोईएम नमूना तैयारी विधियां नमूनों को हाइड्रोफोबिक एयर-वाटर इंटरफेस (एडब्ल्यूआई) में उजागर करती हैं, जो अक्सर उन मुद्दों का परिचय देती हैं जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण को सीमित करते हैं। यह स्थापित किया गया है कि जैविक नमूनों में एडब्ल्यूआई के संपर्क में आने पर प्रकृति को नष्ट करने की उच्च प्रवृत्ति होती है, जिससे जटिल एकत्रीकरण और विघटन 11,12,13,14 हो सकता है। इसके अलावा, जैविक नमूनों की सतहों पर हाइड्रोफोबिक पैच कणों को बर्फ12 में पसंदीदा झुकाव अपनाने का कारण बनता है। कई परिदृश्यों में, नमूने का एक एकल हाइड्रोफोबिक क्षेत्र सभी कणों को बर्फ में एक विलक्षण अभिविन्यास अपनाने के लिए मजबूर करता है, जिससे एक विश्वसनीय पुनर्निर्माण उत्पन्न करने की क्षमता समाप्त हो जाती है। एडब्ल्यूआई के साथ मुद्दों के अलावा, नमूने फिल्म की फेनेस्टेड परत की सतह के लिए एक आत्मीयता प्रदर्शित कर सकते हैं, छेद15 के भीतर बर्फ में निलंबित कणों की संख्या को सीमित कर सकते हैं।
एडब्ल्यूआई या फिल्म16,17 के साथ बातचीत से उत्पन्न होने वाले इन मुद्दों को कम करने के लिए कई पद्धतिऔर तकनीकी समाधान विकसित किए गए हैं। एक लोकप्रिय दृष्टिकोण ईएम ग्रिड की फेनेस्टेड फिल्म को अनाकार कार्बन की एक पतली (दसियों नैनोमीटर) परत के साथ कोट करना है। यह कोटिंग छिद्रों में एक निरंतर सतह प्रदान करती है जिसमें कण सोख सकते हैं, जिसमें एडब्ल्यूआई15,18,19,20 के साथ बातचीत से नमूने को आंशिक रूप से परिरक्षित करने का लाभ होता है। हालांकि, अतिरिक्त कार्बन परत छवि वाले क्षेत्रों में पृष्ठभूमि संकेत की मात्रा को बढ़ाती है, शोर पेश करती है जो प्राप्य संकल्प से समझौता कर सकती है, खासकर छोटे (<150 केडीए) नमूनों के लिए। हाल के वर्षों में, क्रायोईएम ग्रिड पर सहायक फिल्मों का उत्पादन करने के लिए ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) फ्लेक्स का उपयोग पारंपरिक अनाकार कार्बन पर फायदे दिखाया गया है। जीओ फ्लेक्स ग्रेफाइट परतों के ऑक्सीकरण के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मोनोलेयर ग्रेफाइट की छद्म-क्रिस्टलीय चादरें होती हैं जो सतहों और किनारों पर कार्बोक्सिल, हाइड्रॉक्सिल और एपॉक्सी समूहों के रूप में उनकी पर्याप्त ऑक्सीजन सामग्री के कारण हाइड्रोफिलिक होती हैं। जलीय निलंबन में वाणिज्यिक जीओ फ्लेक्स सस्ती हैं, और ईएम ग्रिड18,21 पर जीओ फ्लेक्स लागू करने के लिए कई प्रकाशित तरीके हैं। हालांकि, इन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर ग्रिड होते हैं जो केवल आंशिक रूप से जीओ फ्लेक्स के साथ कवर होते हैं, साथ ही ऐसे क्षेत्र जिनमें जीओ फ्लेक्स की कई परतें होती हैं। इसके अलावा, जीओ फ्लेक्स क्रायोईएम छवियों के लिए एक ध्यान देने योग्य पृष्ठभूमि संकेत का योगदान करते हैं जो पतली अनाकार कार्बन22,23 के साथ देखे जाने के करीब है।
प्राचीन मोनोलेयर ग्राफीन, जिसमें कार्बन परमाणुओं की एक 2 डी क्रिस्टलीय सरणी होती है, जीओ से अलग है क्योंकि यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में चरण कंट्रास्ट का उत्पादन नहीं करता है। इस प्रकार मोनोलेयर ग्राफीन का उपयोग इमेजिंग जैविक नमूनों के लिए एक अदृश्य समर्थन परत उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। मोनोलेयर ग्राफीन भी जीओ की तुलना में मजबूत है और इसे ईएम ग्रिड पर एकल मोनोलेयर के रूप में लागू किया जा सकता है, और ग्राफीन-लेपित ईएम ग्रिड के निर्माण में हालिया प्रगति ने24,25,26,27,28,29,30 में उच्च कवरेज मोनोलेयर ग्राफीन ग्रिड तैयार करना संभव बना दिया है।. हालांकि, क्रायोईएम संरचना निर्धारण के लिए ग्राफीन-लेपित ग्रिड का उपयोग करने के लाभों के बावजूद, वाणिज्यिक विकल्पों के निषेधात्मक खर्च और इन-हाउस उत्पादन की जटिलता के कारण उनका व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। यहां, हम जैविक नमूनों के क्रायोईएम संरचना निर्धारण के लिए ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ कवर किए गए ईएम ग्रिड को प्रभावी ढंग से उत्पादन करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका का वर्णन करते हैं (चित्रा 1)। इस विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन करके, क्रायोईएम शोधकर्ता एक ही दिन में दर्जनों उच्च गुणवत्ता वाले ग्राफीन सपोर्ट ग्रिड तैयार कर सकते हैं। ग्राफीन-लेपित ग्रिड की गुणवत्ता को एलएबी 6 फिलामेंट से लैस कम अंत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग करके आसानी से जांच की जा सकती है।
विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में जैविक नमूनों का संरक्षण उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम संरचना निर्धारण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, शोधकर्ताओं को अक्सर एडब्ल्यूआई के साथ बातचीत से उत्पन्न होने वाली समस्याओं का सामना करना पड़ता है, जो पसंदीदा अभिविन्यास, जटिल विघटन, विकृतीकरण और एकत्रीकरण का परिचय देता है। इसके अलावा, नमूने हमेशा एक फेनेस्टेड फिल्म के छेद में निलंबित पतली बर्फ को आबाद करने के लिए पर्याप्त रूप से केंद्रित नहीं किए जा सकते हैं। कई शोध समूहों ने इन सीमाओं में से कुछ24,25,26,27,28,29,30 को दूर करने में मदद करने के लिए ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ ईएम ग्रिड को कोट करने के तरीके विकसित किए हैं, और ग्राफीन ग्रिड का उपयोग बड़ी सफलता के साथ किया गया है। यहां, हम घर में ग्राफीन ग्रिड के बैचों को प्रभावी ढंग से तैयार करने और टीईएम द्वारा ग्राफीन ग्रिड की गुणवत्ता की जांच करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करते हैं। हम इस बात पर जोर देते हैं कि कुछ महत्वपूर्ण चरणों के दौरान विशेष देखभाल की जानी चाहिए, जिसे हम नीचे रेखांकित करते हैं।
ग्राफीन में हवाई दूषित पदार्थों को आकर्षित करने की एक मजबूत प्रवृत्ति है। इसलिए, ग्राफीन ग्रिड निर्माण प्रक्रिया के दौरान, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि ग्राफीन / क्यू शीट या ग्रिड के साथ संपर्क करने वाले सभी उपकरण साफ और धूल मुक्त हैं। ग्राफीन को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास कवरलिप्स को इथेनॉल और डीआई पानी से धोकर या एयर-डस्टर का उपयोग करके साफ किया जा सकता है। यह भी सलाह दी जाती है कि फ्यूम हुड के तहत काम करें और ग्राफीन शीट और ग्रिड को हर समय पन्नी या साफ ग्लास प्लेट से ढककर रखें। ग्रिड पर धूल या दूषित पदार्थ ग्राफीन को ईएम ग्रिड का पूरी तरह से पालन करने से रोक सकते हैं। ग्राफीन या ग्राफीन-लेपित ग्रिड को संभालते समय, स्थिर निर्वहन से ग्राफीन फिल्म को नुकसान को रोकने के लिए विद्युत रूप से जमीन पर होना महत्वपूर्ण है। कलाई ग्राउंडिंग स्ट्रैप का उपयोग करके, हर बार ग्राफीन या ग्राफीन ग्रिड को संभालने के दौरान एक ग्राउंडेड धातु की वस्तु को छूने, और / या चिमटी को पकड़ने वाले हाथ पर दस्ताने न पहनने से स्थैतिक निर्वहन से बचा जा सकताहै।
चूंकि ग्राफीन का एक मोनोलेयर बहुत पतला (कार्बन परमाणु की चौड़ाई) है, इसलिए ग्रिड में ग्राफीन के हस्तांतरण के दौरान एमएमए या पॉली-एमएमए (पीएमएमए) जैसी कार्बनिक परत के साथ ग्राफीन का समर्थन करना महत्वपूर्ण है। पीएमएमए ग्राफीन हस्तांतरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सामग्री है। हालांकि, पीएमएमए का ग्राफीन के साथ एक मजबूत संबंध है और अक्सर ग्राफीन फिल्म पर बहुलक संदूषण हो सकता है। एमएमए का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है, क्योंकि यह कम अवशिष्ट संदूषण25 छोड़ देता है। हालांकि, पीएमएमए और एमएमए दोनों में झुर्रियों और दरारें बनाने का नुकसान है जो ग्राफीन फिल्म (चित्रा 3 बी) के कुछ क्षेत्रों में देखा जा सकता है। इन झुर्रियों से बचना चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि वे आमतौर पर सीवीडी विधि31 द्वारा ग्राफीन विकास के दौरान होते हैं। झुर्रियों के बिना अल्ट्रा-फ्लैट ग्राफीन उगाने के लिए हाल ही में एक विधि विकसित की गई है, जिससे तांबे की पन्नी को विकास सब्सट्रेट32 के रूप में सीयू (111)/नीलम वेफर द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।
हमारे अनुभव के आधार पर, निर्माताओं से बहुलक-कवर क्यू-ग्राफीन शीट खरीदने की तुलना में ग्राफीन / सीयू शीट खरीदना और एमएमए के साथ ग्राफीन का समर्थन करना बेहतर है, जो तांबे की नक़्क़ाशी के बाद भंगुर हो जाते हैं और बाद के चरणों में संभालना मुश्किल होता है। एमएमए कोटिंग के लिए हमने जिस स्पिन कोटर का उपयोग किया है, उसे स्थानीय कंप्यूटर / हार्डवेयर स्टोर से भागों का उपयोग करके सस्ते में बनाया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित25 है।
एमएमए कोटिंग के चरण के दौरान, एमएमए के साथ क्यू-ग्राफीन शीट पर ग्राफीन सतह की संपूर्णता को कवर करना महत्वपूर्ण है। सीयू को दूर करने के बाद, एमएमए-ग्राफीन अर्ध-पारदर्शी हो जाएगा, और एमएमए कवरेज की कमी वाले क्षेत्र खाली छेद की तरह दिखेंगे। तांबे की तरफ एमएमए कोटिंग को रोकने के लिए, कोटिंग के दौरान इसके नीचे ब्लोटिंग पेपर का एक छोटा टुकड़ा रखना महत्वपूर्ण है ताकि यह सीवीडी फिल्म से बाहर निकलने वाले किसी भी अतिरिक्त एमएमए को सोख ले।
नक़्क़ाशी और कुल्ला करने के बाद, एमएमए / ग्राफीन शीट को पानी के स्तर को नियंत्रित करने के लिए सिरिंज या पेरिस्टालिक पंप के साथ वाणिज्यिक या होममेड ट्रफ सिस्टम का उपयोग करके ईएम ग्रिड में स्थानांतरित करने के लिए तैयार किया जाता है। स्थानांतरण चरण से पहले, क्लोरोफॉर्म, एसीटोन और आईपीए के लगातार स्नान में ग्रिड को अच्छी तरह से पूर्वनिर्धारित करना महत्वपूर्ण है। 65 डिग्री सेल्सियस पर बेकिंग ग्राफीन-लेपित ग्रिड ग्राफीन अखंडता को संरक्षित करने में मदद करता है और ग्रिड में ग्राफीन के सोखने को बढ़ावा देता है। अंत में, ग्रिड पर एमएमए संदूषण को रोकने के लिए, एसीटोन स्नान में एमएमए को अच्छी तरह से हटाना और आईपीए में ग्रिड को साफ करना महत्वपूर्ण है। ईएम ग्रिड पर किसी भी बिना धोए एमएमए अवशेष ों को देखा जाएगा और छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम किया जाएगा (चित्रा 3 सी)। एसीटोन-आईपीए धोने की प्रक्रिया को ग्राफीन सतहों को और साफ करने के लिए दोहराया जा सकता है।
ग्राफीन ग्रिड को हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करने के लिए, हमने ग्रिड को यूवी / ओजोन से अवगत कराया। ओजोन क्लीनर के विभिन्न मॉडलों को ग्राफीन को नुकसान पहुंचाए बिना क्रायोईएम नमूना तैयारी के लिए ग्राफीन परत को पर्याप्त रूप से ऑक्सीजन करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सिस्टम के बावजूद, यूवी / ओजोन उपचार के तुरंत बाद क्रायोईएम नमूना आवेदन के लिए इन ग्रिडों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। ग्राफीन ग्रिड हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करने के वैकल्पिक तरीकों को अन्य अध्ययनों33,34 में वर्णित किया गया है।
The authors have nothing to disclose.
हम स्क्रिप्स रिसर्च में इन विधियों को स्थापित करते समय सहायक चर्चाओं के लिए डॉ जिओ फैन को धन्यवाद देते हैं। बीबी को हेविट फाउंडेशन फॉर मेडिकल रिसर्च से एक पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। डब्ल्यू.सी. को नेशनल साइंस फाउंडेशन प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। डी.ई.पी. को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान NS095892 जीसीएल द्वारा समर्थित है। इस परियोजना को एनआईएच अनुदान GM142196, GM143805 और जीसीएल को S10OD032467 द्वारा भी समर्थित किया गया था।
70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
Flask | Pyrex | 4980-500 | |
Fork | Supermarket | N/A | |
Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |