Her beskriver vi en protokoll for å påføre et enkelt monolag av grafen til elektronmikroskopigitter og hvordan de skal klargjøres for bruk i kryoEM-strukturbestemmelse.
Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har dukket opp som en kraftig teknikk for å undersøke atomstrukturen til makromolekylære komplekser. Prøvepreparering for kryoEM krever konservering av prøver i et tynt lag av glassaktig is, vanligvis suspendert i hullene i en fenestrert støttefilm. Imidlertid eksponerer alle vanlige prøveprepareringsmetoder for kryoEM-studier prøven for luft-vanngrensesnittet, noe som introduserer en sterk hydrofob effekt på prøven som ofte resulterer i denaturering, aggregering og kompleks dissosiasjon. Videre påvirker foretrukne hydrofobe interaksjoner mellom regioner av prøven og luft-vanngrensesnittet orienteringene som er vedtatt av makromolekylene, noe som resulterer i 3D-rekonstruksjoner med anisotrop retningsoppløsning.
Adsorbsjon av cryoEM-prøver til et monolag av grafen har vist seg å bidra til å redusere interaksjoner med luft-vanngrensesnittet samtidig som innføringen av bakgrunnsstøy minimeres. Grafenstøtter gir også fordelen av å redusere den nødvendige konsentrasjonen av proteiner som kreves for kryoEM-avbildning betydelig. Til tross for fordelene med disse støttene, er grafenbelagte nett ikke mye brukt av kryoEM-samfunnet på grunn av uoverkommelige kostnader for kommersielle alternativer og utfordringene forbundet med storskala intern produksjon. Dette papiret beskriver en effektiv metode for å forberede partier av kryoEM-nett som har nesten full dekning av monolags grafen.
Enkeltpartikkelkryogen elektronmikroskopi (kryoEM) er en stadig mer anvendelig teknologi som brukes til å undersøke 3D-strukturer av biomakromolekyler. Teknologiske fremskritt innen elektronmikroskoptikk, direkte elektrondeteksjon1 og datamaskinalgoritmer 2,3,4 i løpet av det siste tiåret har gjort det mulig for cryoEM-brukere å bestemme strukturene til biokjemisk stabile makromolekylære komplekser til nær atomoppløsning 5,6,7,8 . Til tross for disse fremskrittene er det fortsatt bemerkelsesverdige barrierer for å bevare prøver for kryoEM-avbildning, noe som forhindrer at flertallet av biologiske prøver blir løst til slike høye oppløsninger.
Prøvepreparering for høyoppløselig kryoEM-analyse innebærer å fange makromolekyler som er jevnt fordelt i et bredt spekter av orienteringer i et tynt lag av forglasset is. “Blot and plunge” -metodene for frysing er de mest brukte metodene som brukes til å generere tynne filmer av biologiske prøver på rutenett for cryoEM-studier 9,10. Disse metodene innebærer å påføre noen mikroliter prøveløsning på et EM-rutenett som inneholder en fenestrert film som er gjort hydrofil og deretter blotte bort størstedelen av prøven med filterpapir før du raskt kaster rutenettet inn i en kryogen av flytende etan eller etan-propanblanding9.
Selv om denne metoden med hell har blitt brukt til å bestemme strukturer av et bredt spekter av biologiske prøver, eksponerer alle vanlige kryoEM-prøveprepareringsmetoder prøver for det hydrofobe luft-vanngrensesnittet (AWI), som ofte introduserer problemer som begrenser strukturbestemmelse med høy oppløsning. Det er fastslått at biologiske prøver har en høy tilbøyelighet til å denaturere når de utsettes for AWI, noe som kan føre til kompleks aggregering og demontering11,12,13,14. Videre fører hydrofobe flekker på overflaten av biologiske prøver til at partikler får foretrukne retninger i isen12. I mange scenarier tvinger en enkelt hydrofob region av prøven alle partikler til å vedta en singulær orientering i isen, og dermed avskaffe evnen til å generere en pålitelig rekonstruksjon. I tillegg til problemer med AWI, kan prøver demonstrere en affinitet for overflaten av det fenestrerte laget av film, noe som begrenser antall partikler suspendert i isen i hullene15.
Flere metodiske og teknologiske løsninger er utviklet for å redusere disse problemene som oppstår ved interaksjon med AWI eller filmene16,17. En populær tilnærming er å belegge den fenestrerte filmen til EM-nettene med et tynt (titalls nanometer) lag av amorft karbon. Dette belegget gir en kontinuerlig overflate over hullene som partikler kan adsorbere, med fordelen av delvis skjerming av prøven fra interaksjoner med AWI15,18,19,20. Det ekstra karbonlaget øker imidlertid mengden bakgrunnssignal i de avbildede områdene, og introduserer støy som kan kompromittere oppnåelig oppløsning, spesielt for små (<150 kDa) prøver. I de senere år har bruken av grafenoksid (GO) flak for å produsere støttefilmer på kryoEM-nett vist seg å ha fordeler i forhold til tradisjonelt amorft karbon. GO-flak produseres gjennom oksidasjon av grafittlag, noe som resulterer i pseudokrystallinske ark av monolagsgrafitt som er hydrofile på grunn av deres betydelige oksygeninnhold i form av karboksyl-, hydroksyl- og epoksygrupper på overflatene og kantene. Kommersielle GO-flak i vandige suspensjoner er billige, og det er mange publiserte metoder for å påføre GO-flak på EM-nett18,21. Imidlertid resulterer disse metodene ofte i rutenett som bare er delvis dekket med GO-flak, samt regioner som inneholder flere lag med GO-flak. Videre bidrar GO-flak med et merkbart bakgrunnssignal til cryoEM-bilder som er nær det som er observert med tynt amorft karbon22,23.
Uberørt monolagsgrafen, som består av et enkelt 2D-krystallinsk utvalg av karbonatomer, er forskjellig fra GO ved at det ikke produserer fasekontrast i elektronmikroskopet. Monolags grafén kan dermed brukes til å generere et usynlig støttelag for avbildning av biologiske prøver. Monolagsgrafen er også sterkere enn GO og kan påføres som et enkelt monolag på et EM-rutenett, og nylige fremskritt innen fabrikasjon av grafenbelagte EM-nett har gjort det mulig å forberede høydekkende monolags grafengitter internt 24,25,26,27,28,29,30 . Til tross for fordelene ved å bruke grafenbelagte nett for bestemmelse av kryoEM-struktur, er de imidlertid ikke mye brukt på grunn av den uoverkommelige kostnaden for kommersielle alternativer og kompleksiteten i intern produksjon. Her beskriver vi en trinnvis veiledning for effektivt å produsere EM-nett dekket med et monolag grafen for kryoEM-strukturbestemmelse av biologiske prøver (figur 1). Ved å følge denne detaljerte protokollen kan cryoEM-forskere reproduserbart forberede dusinvis av høykvalitets grafenstøttenett på en enkelt dag. Kvaliteten på de grafenbelagte nettene kan lett undersøkes ved hjelp av et lav-end transmisjonselektronmikroskop (TEM) utstyrt med et LaB6-filament.
Bevaring av biologiske prøver i et tynt lag av glassaktig is er et kritisk viktig skritt for høyoppløselig kryoEM-strukturbestemmelse. Imidlertid støter forskere ofte på problemer som oppstår ved interaksjoner med AWI, som introduserer foretrukket orientering, kompleks demontering, denaturering og aggregering. Videre kan prøvene ikke alltid konsentreres tilstrekkelig til å fylle den tynne isen som henger over hullene i en fenestrert film. Flere forskningsgrupper har utviklet metoder for å belegge EM-nett med et monolag av grafen for å overvinne noen av disse begrensningene 24,25,26,27,28,29,30, og grafennett har blitt brukt med stor suksess. Her gir vi trinnvise instruksjoner for effektivt å forberede batcher av grafennett internt og undersøke kvaliteten på grafennettene av TEM. Vi understreker at det bør utvises spesiell forsiktighet under noen av de kritiske trinnene, som vi skisserer nedenfor.
Grafen har en sterk tendens til å tiltrekke seg luftbårne forurensninger. Derfor, under grafengitterfabrikasjonsprosessen, er det viktig å sørge for at alle verktøyene som kommer i kontakt med grafen / Cu-arket eller ristene er rene og støvfrie. Glassdeksler som brukes til å overføre grafen kan rengjøres ved å skylle med etanol og DI-vann eller bruke en luftstøver. Det anbefales også å arbeide under en avtrekkshette og holde grafenplater og rister dekket med folie eller en ren glassplate til enhver tid. Støv eller forurensninger på nettene kan forhindre grafen i å feste seg grundig til EM-nettene. Ved håndtering av grafen eller grafenbelagte nett er det viktig å være elektrisk jordet for å forhindre skade på grafenfilmen fra statisk utladning. Statisk utladning kan unngås ved å bruke en jordingsstropp på håndleddet, berøre en jordet metallgjenstand hver gang grafen- eller grafengitter håndteres, og / eller ikke ha på seg en hanske på hånden som holder pinsetten24.
Siden et monolag av grafen er veldig tynt (bredden på et karbonatom), er det viktig å støtte grafen med et organisk lag som MMA eller poly-MMA (PMMA) under overføring av grafen til nett. PMMA er det mest brukte materialet for grafenoverføring. PMMA har imidlertid en sterk affinitet med grafen og kan ofte resultere i polymerforurensning på grafenfilmen. MMA brukes i denne protokollen, da den etterlater mindre restforurensning25. Imidlertid har både PMMA og MMA den ulempen at de danner rynker og sprekker som kan observeres i enkelte områder av grafenfilmen (figur 3B). Det kan være utfordrende å unngå disse rynkene da de ofte forekommer under grafenvekst ved CVD-metoden31. Det er nylig utviklet en metode for dyrking av ultraflatt grafén uten rynker, der kobberfolien erstattes av en Cu(111)/safirskive som vekstsubstrat32.
Basert på vår erfaring er det bedre å kjøpe grafen / Cu-ark og støtte grafen med MMA internt enn å kjøpe polymerbelagte Cu-graphen-ark fra produsenter, som blir sprø etter kobberetsing og er vanskelige å håndtere i etterfølgende trinn. Spinnbelegget vi brukte til MMA-belegg kan bygges billig ved hjelp av deler fra en lokal datamaskin/jernvarehandel, som tidligere beskrevet25.
Under trinnet med MMA-belegg er det viktig å dekke hele grafenoverflaten på Cu-graphene-arket med MMA. Etter at Cu har blitt etset bort, vil MMA-grafen bli semi-gjennomsiktig, og områder som mangler MMA-dekning vil se ut som tomme hull. For å forhindre MMA-belegg på kobbersiden, er det viktig å plassere et lite stykke blottingspapir under det under belegget slik at det suger opp overflødig MMA som spinner ut fra CVD-filmen.
Etter etsing og skylling er MMA / grafenarket klart til å overføres til EM-nett ved å bruke et kommersielt eller hjemmelaget trausystem med sprøyte eller peristaltisk pumpe for å kontrollere vannstanden. Før overføringstrinnet er det viktig å skylle ristene grundig i påfølgende bad av kloroform, aceton og IPA. Baking av grafenbelagte rister ved 65 ° C bidrar til å bevare grafenintegritet og fremmer adsorpsjon av grafen til rutenettene. Til slutt, for å forhindre MMA-forurensning på ristene, er det viktig å fjerne MMA grundig i et acetonbad og rengjøre ristene i IPA. Eventuelle uvaskede MMA-rester vil bli observert på EM-rutenett og redusere signal-støy-forholdet mellom bildene (figur 3C). Aceton-IPA-vaskeprosessen kan gjentas for å rengjøre grafenoverflatene ytterligere.
For å gjøre graféngitter hydrofile, utsatte vi nettene for UV/ozon. Ulike modeller av UV / ozonrensere kan kreve optimalisering for å oksygenere grafenlaget tilstrekkelig for cryoEM-prøvepreparering uten å skade grafen. Uavhengig av systemet er det avgjørende å bruke disse ristene til cryoEM-prøveapplikasjon umiddelbart etter UV/ozonbehandling. Alternative metoder for å gjøre grafengitter hydrofile er beskrevet i andre studier33,34.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Xiao Fan for nyttige diskusjoner mens vi etablerte disse metodene på Scripps Research. B.B. ble støttet av et postdoktorstipendiat fra Hewitt Foundation for Medical Research. WC støttes av et National Science Foundation predoktorstipend. DEP støttes av National Institutes of Health (NIH) tilskudd NS095892 til GCL Dette prosjektet ble også støttet av NIH-tilskudd GM142196, GM143805 og S10OD032467 til G.C.L.
70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
Flask | Pyrex | 4980-500 | |
Fork | Supermarket | N/A | |
Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |