Isolering, odling och adipogeninduktion av stromal vaskulär fraktion-härledda preadipocyter från musperiaortafettvävnad
Summary
Här beskriver vi isolering, odling och adipogen induktion av stromala vaskulära fraktionshärledda preadipocyter från musperiaortafettvävnad, vilket möjliggör studier av perivaskulär fettvävnadsfunktion och dess förhållande till vaskulära celler.
Abstract
Perivaskulär fettvävnad (PVAT) är en fettvävnadsdepå som omger blodkärlen och uppvisar fenotyperna av vita, beige och bruna adipocyter. Nya upptäckter har belyst den centrala roll som PVAT spelar för att reglera vaskulär homeostas och delta i patogenesen av hjärt-kärlsjukdomar. En omfattande förståelse för PFAT:s egenskaper och reglering är av stor betydelse för utvecklingen av framtida terapier. Primära kulturer av periaortafettocyter är värdefulla för att studera PFAT-funktion och överhörning mellan periaortafettocyter och kärlceller. Denna artikel presenterar ett ekonomiskt och genomförbart protokoll för isolering, odling och adipogen induktion av stromala vaskulära fraktionshärledda preadipocyter från musperiaorta fettvävnad, vilket kan vara användbart för modellering av adipogenes eller lipogenes in vitro. Protokollet beskriver vävnadsbearbetning och celldifferentiering för odling av periaortaadipocyter från unga möss. Detta protokoll kommer att utgöra den tekniska hörnstenen på bänksidan för undersökning av PFAT-funktionen.
Introduction
Perivaskulär fettvävnad (PVAT), en perivaskulär struktur som består av en blandning av mogna adipocyter och en stromal vaskulär fraktion (SVF), tros interagera med den intilliggande kärlväggen via dess sekretomer parakrinalt1. Som en kritisk regulator av vaskulär homeostas är PFAT-dysfunktion inblandad i patogenesen av kardiovaskulära sjukdomar 2,3,4. SVF för fettcellsvävnad består av flera förväntade cellpopulationer, inklusive endotelceller, immunceller, mesotelceller, neuronala celler och fettstam- och progenitorceller (ASPC)5,6. Det är välkänt att ASPC som finns i SVF i fettvävnad kan ge upphov till mogna fettceller5. SVF antas vara en kritisk källa till mogna adipocyter i PVAT. Flera studier har visat att PVAT-SVF kan differentiera till mogna adipocyter under specifika induktionsbetingelser 6,7,8.
För närvarande finns det två isoleringssystem för att isolera SVF från fettvävnad, det ena är enzymatisk nedbrytning och det andra är icke-enzymatiskt9. Enzymatiska metoder resulterar vanligtvis i ett högre utbyte av kärnförsedda stamceller10. Hittills har fördelarna med SVF för att främja vaskulär regenerering och neovaskularisering vid sårläkning, urogenitala och kardiovaskulära sjukdomar i stor utsträckning visats11, särskilt inom dermatologi och plastikkirurgi12,13. De kliniska tillämpningsutsikterna för PVAT-härledd SVF har dock inte utforskats väl, vilket kan tillskrivas avsaknaden av en standardiserad metod för isolering av SVF från PVAT. Syftet med detta protokoll är att etablera ett standardiserat tillvägagångssätt för isolering, odling och adipogen induktion av SVF-härledda preadipocyter från mus-PVAT som omger bröstaortan, vilket möjliggör ytterligare undersökning av PFAT-funktionen. Detta protokoll optimerar vävnadsbearbetning och celldifferentieringstekniker för odling av periaortafettceller erhållna från unga möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi föreslår ett praktiskt och genomförbart tillvägagångssätt för isolering och adipogen induktion av SVF-härledda preadipocyter från periaortafettvävnad från möss. Fördelarna med detta protokoll är att det är enkelt och ekonomiskt. Ett tillräckligt antal möss är avgörande för en lyckad isolering, eftersom otillräcklig vävnad kan resultera i låg SVF-densitet och dåligt tillväxttillstånd, vilket i slutändan påverkar den lipogena effektiviteten. Dessutom är musens ålder en viktig faktor att ta …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82130012 och 81830010) och Nurture-projekten för grundforskning vid Shanghai Chest Hospital (anslagsnummer: 2022YNJCQ03).
Materials
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
Riferimenti
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).
