玻璃体和房水标本的游离 DNA 提取用于玻璃体视网膜淋巴瘤的诊断和监测
Summary
本文建立了一种从玻璃体和房水中提取游离 DNA 以进行分子研究以诊断玻璃体视网膜淋巴瘤的程序。该方法能够同时从样品的细胞成分中提取 DNA 或将其保留用于辅助测试。
Abstract
玻璃体视网膜淋巴瘤 （VRL） 是一种侵袭性淋巴瘤，通常被归类为原发性中枢神经系统弥漫性大 B 细胞淋巴瘤。为了诊断VRL，需要收集玻璃体液和最近的房水等标本。对这些标本进行 VRL 的诊断测试包括细胞学、流式细胞术和分子检测。然而，细胞病理学和流式细胞术，以及使用细胞DNA的分子检测，都需要完整的全细胞。挑战在于玻璃体和房水通常具有低细胞性，并且许多细胞在收集、储存和处理过程中被破坏。此外，由于玻璃体液粘度高，玻璃体液和房水体积小，这些标本给分子检测带来了额外的困难。本研究提出了一种从玻璃体和水性标本中提取游离DNA的方法。这种方法补充了细胞DNA的提取，或允许这些标本的细胞成分用于其他诊断方法，包括细胞学和流式细胞术。
Introduction
玻璃体视网膜淋巴瘤 （VRL） 是一种与原发性中枢神经系统弥漫性大 B 细胞淋巴瘤相关的侵袭性淋巴瘤 1,2,3。VRL通常是致命的，因为它受累于中枢神经系统1,2。虽然罕见1,4，但 VRL 通常表现为类似于后葡萄膜炎和其他玻璃体视网膜疾病的症状 4,5。因此，出现葡萄膜炎症状的患者需要诊断以确认或排除 VRL。
最近，发布了诊断 VRL 的共识标准，其中包括临床检查和实验室检查结果的结合6。通常用于诊断 VRL 的标本包括玻璃体液和最近的房水7。玻璃体液是通过称为扁平玻璃体切除术的外科手术获得的，该手术允许进入眼睛的后段8.
在所提出的方案中，收集了房水和玻璃体液标本用于细胞和cfDNA提取。在麻醉患者并将套管针放置在距离角膜缘约 4 mm 处后，使用 1 mL 结核菌素注射器在角膜缘处获得约 100-200 μL 的房水样本。对于假晶状体患者，通过在输注中引入无菌空气来获得未稀释的玻璃体，从而能够收集大量未稀释的玻璃体（最多 3.5 mL）。在有晶状体患者中，在打开平衡盐溶液输注之前，取出约 500 至 1000 μL 未稀释的玻璃体。在某些情况下，通过将输注转换为液体并将玻璃体放置在玻璃体裙内以获得该样品来收集二次稀释的玻璃体（500 至 2,000 μL）。通过在手术结束时保留盒袋（补充图1）来收集最稀的玻璃体部分。一旦这个袋子到达病理科，通过将液体从这个袋子中排出到锥形管中，得到稀释的玻璃体，以便随后提取DNA。
玻璃体液的细胞病理学通常被认为是金标准9.然而，一些研究表明，由于加工和最小细胞性，灵敏度有限10,11,12。流式细胞术可以帮助识别克隆性 B 细胞，但也可能受到低细胞和大淋巴瘤细胞脆性的限制13,14,15。细胞病理学和流式细胞术都需要完整的全细胞。其中许多细胞在收集、储存和处理过程中被破坏。当使用从完整细胞（细胞 DNA）中提取的 DNA 进行分子测试时，它也受到同样的限制。此外，将有限的玻璃体标本分开进行所有这些测试可以减少每个测试的可用材料量。
游离 DNA （cfDNA） 是另一种不需要完整细胞的 DNA 来源。玻璃体标本的 cfDNA 已用于检测 VRL 16,17 以及葡萄膜黑色素瘤18。在该方案中，从玻璃体和水溶液中提取细胞和游离DNA以检测VRL。
Protocol
Representative Results
Discussion
玻璃体视网膜淋巴瘤 （VRL） 是一种侵袭性大 B 细胞淋巴瘤 1,2,3，其症状可以模仿其他玻璃体视网膜疾病 4,5。玻璃体和最近的房水分子检测已成为诊断或排除 VRL 的关键方法。然而，这些液体的体积非常小，并且通常具有低细胞性。这些液体中的许多细胞也可能在收集、储存和处理?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels，MLS（ASCP），MB，QLS，和Helmut Weigelin，MLS（ASCP）在我们的实验室内建立这种提取方法方面发挥了重要作用。
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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