Qui viene stabilita una procedura per estrarre il DNA privo di cellule dall'umor vitreo e acqueo per eseguire studi molecolari per la diagnosi di linfoma vitreoretinico. Il metodo offre la possibilità di estrarre contemporaneamente il DNA dalla componente cellulare del campione o di riservarlo per test ausiliari.
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Articolo metodologico
Estrazione di DNA senza cellule di campioni di vitreo e umor acqueo per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma vitreoretinico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il linfoma vitreoretinico (VRL) rappresenta un linfoma aggressivo, spesso classificato come linfoma primario diffuso a grandi cellule B del sistema nervoso centrale. Per diagnosticare il VRL, vengono raccolti campioni come l'umor vitreo e, più recentemente, l'umor acqueo. I test diagnostici per VRL su questi campioni includono citologia, citometria a flusso e test molecolari. Tuttavia, sia la citopatologia che la citometria a flusso, insieme ai test molecolari che utilizzano il DNA cellulare, richiedono cellule intere intatte. La sfida risiede nel fatto che l'umor vitreo e acqueo hanno in genere una bassa cellularità e molte cellule vengono distrutte durante la raccolta, la conservazione e l'elaborazione. Inoltre, questi campioni pongono ulteriori difficoltà per i test molecolari a causa dell'elevata viscosità dell'umor vitreo e del basso volume sia dell'umor vitreo che dell'umor acqueo. Questo studio propone un metodo per estrarre DNA privo di cellule da campioni vitrei e acquosi. Questo approccio integra l'estrazione del DNA cellulare o consente di utilizzare la componente cellulare di questi campioni per altri metodi diagnostici, tra cui la citologia e la citometria a flusso.
Introduzione
Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo associato al linfoma primario a grandi cellule B diffuso del sistema nervoso centrale 1,2,3. Il VRL è tipicamente fatale a causa del suo coinvolgimento nel sistema nervoso centrale 1,2. Sebbene rara1,4, la VRL si presenta spesso con sintomi simili all'uveite posteriore e ad altre malattie vitreoretiniche 4,5. Di conseguenza, i pazienti che present....
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Protocollo
Il presente protocollo segue le linee guida per l'assistenza umana e con l'approvazione del comitato di revisione istituzionale (IRB) dell'Università del Michigan. Per questo è stata ottenuta una rinuncia al consenso informato da parte dell'IRB. Non ci sono criteri di inclusione o esclusione rilevanti per i pazienti coinvolti.
1. Separazione dei componenti cellulari e cell-free
NOTA: Per il test diagnostico VRL è possibile ricevere tre tipi di campioni: vitreo (non diluito; liquido da vitrectomia raccolto prima dell'inizio dell'infusione), vitreo diluito all'interno di una sacca a cassetta (
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Risultati
Questi metodi di estrazione sono stati eseguiti su un numero limitato di casi per garantire un'adeguata resa e amplifiabilità del DNA libero da cellule rispetto al DNA cellulare dei campioni vitrei (quattro) e acquosi (quattro). Da questi campioni, le rese di DNA dalla componente priva di cellule di questi fluidi sono simili a quelle della componente cellulare (Tabella 1). Anche le cellule e il cfDNA di questi campioni sono stati valutati utilizzando test molecolari, come per la mutazione associata a VRL.......
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Discussione
Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo a grandi cellule B 1,2,3 i cui sintomi possono imitare altre malattie vitreoretiniche 4,5. I test molecolari dell'umor vitreo e, più recentemente, dell'umor acqueo sono diventati un metodo fondamentale per fare la diagnosi di VRL o escluderlo. Tuttavia, questi fluidi hanno un volume molto basso e spesso hanno una ba.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS e Helmut Weigelin, MLS (ASCP) sono stati determinanti nella definizione di questo metodo di estrazione all'interno del nostro laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-propanolo (isopropanolo) | Fischer | A415-500 | |
| DNA pulito e Concentratore-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Pulito & Concentratore-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Soluzione di lisi cellulare | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene Soluzione di idratazione del DNA | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Soluzione di precipitazione proteica | Qiagen | 158912 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Kit per urine | Zymo Research | D3061 | Tampone di condizionamento; include anche perle di pulizia, proteinasi K e colonne di spin |
| Glicogeno ultrapuro, 20 e micro; g/µ L (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
Riferimenti
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al.
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Ristampe e permessi
