Tidlig Unguided Human Brain Organoid Neurovascular nisjemodellering i Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å innpode menneskelige hjerneorganoider ved flere modningsstadier i kyllingens chorioallantoiske membran (CAM). Hjerneorganoider ble dyrket etter ikke-styrte standardiserte protokoller.
Abstract
Engrafting av organoider i vaskularisert vev i modelldyr, som immundefekt mus eller kyllingembryo chorioallantoic membran (CAM), har vist seg å være effektiv for neovaskulariseringsmodellering. CAM er en rikt vaskularisert ekstraembryonal membran, som viser begrenset immunoreaktivitet, og dermed blir en utmerket vertsmodell for celletransplantasjoner av menneskelig opprinnelse.
Dette papiret beskriver strategien for å pode menneskelige hjerneorganoider differensiert på flere modningsstadier inn i CAM. Den cellulære sammensetningen av hjerneorganoider endres med tiden, noe som gjenspeiler milepælene i menneskelig hjerneutvikling. Vi podet hjerneorganoider i relevante modningsstadier: nevroepitelial ekspansjon (18 DIV), tidlig nevrogenese (60 DIV) og tidlig gliogenese (180 DIV) inn i alternativ behandling hos embryonale dag (E)7 kyllingembryoer. Engrafted hjerneorganoider ble høstet 5 dager senere og deres histologiske egenskaper ble analysert.
Det ble ikke påvist histologiske tegn til neovaskularisering i de transplanterte organoidene eller unormale blodkar ved siden av transplantatene. Videre ble det observert bemerkelsesverdige endringer i den cellulære sammensetningen av de podede organoider, nemlig en økning i antall glialfibrillære sure protein-positive-reaktive astrocytter. De cytoarkitektoniske forandringene var imidlertid avhengig av organoidmodningsstadiet. Samlet sett antyder disse resultatene at hjerneorganoider kan vokse i CAM, og de viser forskjeller i cytoarkitekturen avhengig av modningsstadiet ved poding.
Introduction
Menneskelige hjerneorganoider er en fremvoksende teknikk som gjør at vi kan rekapitulere den tidlige utviklingen av den menneskelige hjerne in vitro 1,2,3. Likevel er en av de største begrensningene i denne modellen mangelen på vaskularisering, som spiller uunnværlige roller, ikke bare i hjernens homeostase, men også i hjernens utvikling4. I tillegg til levering av oksygen og næringsstoffer, tyder akkumulerende bevis på at hjernens vaskulære system regulerer nevral differensiering, migrasjon og synaptogenese under utvikling 5,6. Derfor er det et presserende behov for å etablere pålitelige modeller som kan gi den manglende vaskulære signaleringen og strukturen til hjerneorganoider, og øke kompleksiteten til menneskelig hjerneorganoid generasjon7.
Blant de foreslåtte metodene for vaskularisering kan to hovedstrømlinjer vurderes: organoid engrafting i en levende organisme og rent in vitro-teknologier som dyrker endotelceller og nevrale celler 8,9,10,11,12. Intracerebral transplantasjon hos mus er kostbart og tidkrevende, noe som gjør andre teknologier relevante for enklere modeller. Chick chorioallantoic membran (CAM) analysen har blitt brukt mye for å studere angiogenese 13,14,15. I det siste tiåret har flere grupper vellykket enpodet forskjellige typer organoider, inkludert nyre16,17, hjerte18 og tumororganoider19,20, i CAM. Likevel er lite kjent om effekt, toksisitet / avvisning, fysiologisk effekt og metoder for å innpode menneskelige hjerneorganoider i CAM. Et annet interessant og ennå uutforsket aspekt er dannelsen av en kimær blod-hjernebarriere (BBB) mellom CAM og det organoide astrocytiske grensesnittet. Tidligere banebrytende arbeid antydet den antatte muligheten for å generere en BBB i CAM ved å transplantere astrocytter og astrocyttbetinget medium 21,22,23. Imidlertid ser modne astrocytter ut til å være ute av stand til å oppnå dette24,25. Dermed forblir den astrocytinduserte dannelsen av BBB diskutabel, og transplantasjon av menneskelige hjerneorganoider vil tillate oss å kaste lys over denne kontroversen.
Denne videoartikkelen beskriver en protokoll for en in ovo human hjerneorganoid transplantasjon i CAM som fremmer vekst, forbedring og vaskularisering, noe som resulterer i organoider som omfatter histologisk kompatible BBB-elementer. Her presenterer vi en protokoll som sikrer overlevelse av kyllingembryoet og rapporterer om tillatelsen til CAM for å opprettholde hjerneorganoid vekst.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien beskriver vi en detaljert protokoll med mange viktige trinn som gir gunstig vekst og utvikling av menneskelige hjerneorganoider ved poding uten å forstyrre overlevelsen av kyllingembryoene. Vi anbefalte bruk av sterile nåler for å punktere eggets luftkammer etter 24 timers inkubasjon (dag 1). I tillegg prøvde vi også å gjøre punkteringen på dag 4 (etter å ha sjekket gjennom eggeskallet med lys for å teste utviklingen av vaskulaturen for å være sikker på at vi bare jobbet med friske embryoer)….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Alcántara og Dr. Ortega fra UB og resten av medlemmene i Dr. Acostas laboratorium for innsiktsfulle diskusjoner. SA er Serra-Hunter stipendiat assisterende professor fra Generalitat de Catalunya ved Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
Riferimenti
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
